Soutenance de thèse de Nagham GHADDAR

Le nucléosome, composé d'un octamère d'histone comprenant 2 copies de chaque H2A, H2B, H3 et H4, est l'unité de base de la compaction du matériel génétique autour duquel l'ADN s’enroule. Les molécules d’histones ont une extrémité N-terminale saillante qui est soumise à des modifications post-traductionnelles effectuées par une panoplie d’enzymes appelés modificateurs d'histone qui vont moduler la structure de la chromatine. Celle-ci régule la fonction du génome en contrôlant dynamiquement là l’accessibilité de l'ADN de protéines impliquées dans différents processus biologiques tels que la transcription, la réparation et réplication de l'ADN. Au cours de la réplication de l'ADN, le réplisome peut rencontrer des obstacles qui peuvent perturber la progression de la fourche de réplication (stress réplicatif) et éventuellement conduire à un effondrement de la fourche de réplication et à une instabilité génomique. Les cellules ont évolué pour faire face à ces défis en developpant de multiples mécanismes moléculaires se produisant dans le contexte d’une chromatine organisée. De plus en plus de preuves démontrent le rôle des modificateurs d’histones dans la réponse au stress de réplication. Les histones lysine méthyltransférases ont été associées au développement du cancer, non seulement en raison de leur importance dans l'établissement du paysage épigénétique pour l'expression des gènes, mais aussi pour leur rôle dans la réponse au stress de réplication. Par exemple, il a été démontré que des membres de la famille SET1/MLL, en plus de réguler la méthylation de H3K4, protégeaient et favorisaient le redémarrage des fourches de réplications bloquées et régulaient la progression de la fourche de réplication afin de prévenir les conflits transcription-réplication. Chez Saccharomyces cerevisiae, une unique histone methyl transférase appelée Set1 et agissant au sein d’un complexe (Set1C) methyle la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4). Au cours de ma thèse de doctorat, j'ai étudié le rôle du complexe Set1C, au niveau de la fourche de réplication dont la progression est perturbée par une barrière constituée par un complexe ADN-protéine. La première partie de la thèse consiste à comprendre comment Set1C est recruté au sein de la fourche de réplication bloquée par le complexe ADN-protéine. Pour cela, j’ai utilisé la barrière Tus/Ter composé d'une séquence répétitive d’ADN (Ter) sur laquelle la protéine Tus se lie spécifiquement avec une haute affinité. Nous avons constaté que lors du décrochage de la fourche de réplication au niveau de la barrière, seule une sous-unité de Set1C appelée Spp1 était recrutéé à la barrière. De façon remarquable le recrutement de Spp1 sur la fourche bloquée est indépendant du mécanisme canonique du recrutement de Set1C impliquant l’ARN Polymerase II (Pol II) et la transcription. Ces observations ont soulevé la question : comment Spp1 pourrait être recrutée sur chromatine indépendamment de son association avec Set1C. Curieusement, nous avons constaté que le recrutement de Spp1 dépend de son domaine PHD, un motif de reconnaissance de H3K4 méthylé. Deuxièmement, j'ai étudié les conséquences de l'absence de Spp1, non seulement au niveau de la fourche de réplication perturbée, mais également au niveau du stress de réplication à l'échelle du génome. J'ai pu démontrer que Spp1 et son domaine PHD sont importants pour protéger l'ADN contre la dégradation au sein des fourches de réplication bloquées. En effet, j'ai pu démontrer la présence de nombreuses caractéristiques du stress de réplication non résolu lors de la perte de Spp1 comme l'augmentation d’ADN simple-brin recouvert par RPA et un taux de mutation élevé. Enfin, j'ai étudié l'implication de Spp1 dans le processus normal de réplication de l'ADN et montré que Spp1 affecte la progression de la fourche de réplication très probablement en agissant sur la structure de la chromatine.

Eukaryotic nucleosome is the basic unit of DNA packaging in which DNA is wrapped around histone octamer consisting of 2 copies of each H2A, H2B, H3 and H4. Histones have protruded N-terminal tail that is subjected to post-translational modification by histone modifiers. Subsequently, chromatin structure regulates genome function by dynamically controlling DNA availability to proteins involved in biological processes such as DNA replication. During DNA replication, replisome can encounter impediments that can cause perturbed replication fork (replication stress) that might eventually lead to replication fork collapse and drives genomic instability. Fortunately, cells have evolved to cope with these challenges through multiple molecular mechanisms in which all occur in context of chromatin. Indeed, growing evidences demonstrate the role of chromatin modifiers in replication stress response. Histone lysine methyltransferases are linked to cancer development not only because of their importance in establishing epigenetic landscape for gene expression but also for their role in replication stress response. For instance, SET1/MLL family members, in addition to H3K4 methylation regulation, were shown to either promote fork recovery, protect the stalled replication fork, regulate replication fork progression and prevents transcription-replication conflicts. During my PhD thesis, I investigated the role of the unique Set1C in Saccharomyces cerevisiae at perturbed replication fork. First part of the thesis is to shed the light on whether and how Set1C would be recruited to stalled replication fork caused by DNA-protein complexes. Therefore, I used Tus/Ter barrier system that composed of repetitive sequence (Ter) where Tus protein specifically binds to Ter with high affinity. We found that, during replication fork stalling, not all Set1C subunits were recruited, rather only Spp1 was recruited. Knowing that recruitment of Set1C to chromatin has been associated with its interaction with RNA polymerase II, we found that Spp1 recruitment to stalled fork was independent of transcription. These observations raised the question of how Spp1 could be recruited to chromatin independent of its association with Set1C. Intriguingly, we found that Spp1 recruitment depends on its PHD finger domain, a motif recognizing H3H4 di- and tri-methylated. Second, I investigated the consequence of Spp1 absence not only at perturbed replication fork but also genome wide replication stress. I was able to demonstrate that Spp1 and its PHD finger domain are important to protect the DNA from excessive processing after replication fork perturbation. Indeed, I found numerous hallmarks of replication stress upon Spp1 loss including increase in RPA-coated ssDNA and mutation rate. Finally, I investigated Spp1 involvement in the normal process of DNA replication and show that Spp1 affects progression of the replication fork most probably by means linked to chromatin replication. Overall, my thesis work shed the light on a new mechanism on how chromatin structure through Spp1 regulates DNA replication and replication stress response.