Soutenance de thèse de Mériem MERROUCH

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie - Spécialité Microbiologie
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
relations structure/fonction,maturation,métalloenzyme,CO2,électrochimie,mécanisme catalytique
Keywords
Structure/Function relashionship,maturation,metalloenzyme,CO2,Electrochemistry,Mechanism of Catalysis
Titre de thèse
Mécanisme, maturation et biodiversité d’une enzyme à cofacteur NiFe, importante dans le contexte de l'énergie et de l'environnement: la carbone monoxyde déshydrogénase
Mecanism, maturation and biodiversity of the enzyme carbon monoxide dehydrogenase
Date
Mercredi 25 Octobre 2017 à 10:00
Adresse
31, chemin Joseph Aiguier 13009 Marseille
Amphithéâtre Pierre Desnuelles
Jury
Directeur de these Sébastien DEMENTIN CNRS, Marseille Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines (UMR 7281) Institut de Microbiologie de la Méditerranée
Examinateur Petra HELLWIG Laboratoire de Bioélectrochimie et Spectroscopie, UMR 7140, Chimie de la matière complexe,
Rapporteur Beatrice GOLINELLI Laboratoire de Chimie des Processus Biologiques, Collège de France
Rapporteur Vincent NIVIERE Laboratoire Chimie et Biologie des Métaux CEA-Grenoble
Examinateur Corinne AUBERT Laboratoire de Chimie Bactérienne, CNRS Marseille UMR 7283, Institut de Microbiologie de la Méditerranée
Examinateur Jalila SIMAAN CNRS, Institut des Sciences moléculaires de Marseille UMR 7313

Résumé de la thèse

Les CO-Déshydrogénases (CODH) catalysent l’oxydation réversible du CO en CO2 selon la réaction : CO + H2O ↔ CO2 + 2e- + 2H+ . Le site actif des CODH homodimériques est constitué d’un centre [Ni-4Fe-4S]. La CODH contient 3 autres centres Fer-soufre dont un à l’interface des deux monomères. Nous avons étudié différents aspects de la réactivité de CODHs provenant de divers micro-organismes : leur fonction physiologique, la maturation de leur site actif, leur mécanisme catalytique et leur réactivité vis-à-vis de l’O2. Ces enzymes sont réputées être extrêmement sensibles à l’O2, cependant le mécanisme d’inactivation par l’oxygène n'était pas connu. Nous avons étudié par électrochimie directe l’effet de l’oxygène sur différentes CODHs et montré que l’oxygène inhibe rapidement le site actif, mais qu’il est possible de réactiver l’enzyme partiellement ou totalement par réduction. Nous avons également démontré que la sensibilité à l'O2 varie d’une CODH à l’autre. Afin de caractériser la chaîne de transfert d’électron de la CODH de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, nous avons analysé par des approches biochimiques, électrochimiques et spectroscopiques différents mutants de la CODH. Nous avons, par mutagénèse dirigée, modifié le centre [2Fe-2S] interfacial, soit pour le convertir en centre [4Fe-4S] soit pour l’éliminer complètement. Nos résultats montrent que la sensibilité vis-à-vis de l’O2 des CODH ne dépend pas de la nature de ce centre fer-soufre, mais que, étonnamment, sa présence favorise l’insertion du nickel dans le site actif. Pour comprendre la fonction de la protéine accessoire CooC dans la maturation du site actif de la CODH de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, nous avons entrepris différentes approches pour produire cette maturase et nous avons comparé les structures cristallographiques des CODHs produites en présence ou en absence de la maturase. Nos données sont cohérentes avec les résultats obtenus précédemment : CooC est nécessaire à l’insertion du nickel. Certains micro-organismes se servent de la CODH pour utiliser le CO comme seule source de carbone et d’énergie. Ce n’est pas le cas de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, mais cette bactérie consomme le CO lorsqu’il est ajouté au milieu. Nous avons remis en question l’hypothèse que la CODH a un rôle dans la détoxification, en montrant que la CODH confère un avantage physiologique à Desulfovibrio vulgaris Hildenborough en absence de CO, et est importante dans le métabolisme énergétique et la production de biomasse dans certaines conditions.

Thesis resume

CO-dehydrogenases (CODH) catalyze the reversible reduction of CO2 to CO according to CO2 + 2e- + 2H+ ↔ CO + H2O. CODH are homodimeric enzymes which contain an inorganic [Ni-4Fe-4S] active site and three iron-sulfur clusters, one of which is at the interface between the two monomers. We studied various properties of CODH from different microorganisms, including their physiological function, the maturation of their active site, their catalytic mechanism, and their reaction with O2. CODHs are deemed to be “extremely” sensitive to O2. However, no studies related to the mechanism of inhibition of CODHs by O2 had been conducted. We used protein film voltammetry to study the effect of O2 on different CODHs and we showed that CODHs are strongly inhibited by O2 but the inactivation can be partially or completely reverted by reduction. Moreover, the extent of reactivation varies from one CODH to the other. To characterize the iron sulfur clusters chain of CODH from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, we studied by biochemical, electrochemical, and spectroscopic approaches, different mutants of CODH. By site-directed mutagenesis, we modified the [2Fe-2S] cluster at the interface of the two monomers to converted it into a [4Fe-4S] cluster or to deleted it altogether. We showed that oxygen sensitivity does not depend on the nature of this iron-sulfur cluster and that, surprisingly, its presence determines the insertion of nickel into the active site. To understand the function of the accessory protein CooC in the maturation of the active site of CODH, we used several approaches to produce CooC from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough and we compared the crystallographic structures of CODH produced in absence or in presence of CooC. Our data support the hypothesis that CooC is essential for nickel insertion into the active site of CODH. Some organisms grow on CO as sole source of carbon and energy by using CODH. This is unlike Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Indeed, this bacterium consumes CO from the growth medium, which lead to a proposed role of detoxification. However, we have shown that CODH from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough confers physiological advantages in the absence of CO and is important for energy metabolism and biomass production under certain conditions.