Soutenance de thèse de Micaela BOIERO SANDERS

Une question centrale dans le domaine de l’actine est de comprendre comment la molécule d'actine s'assemble en différentes structures pour effectuer une variété de fonctions. L’analyse minutieuse des génomes eucaryotes indique que les espèces pourraient avoir élaboré différentes stratégies pour atteindre cet objectif. Certaines espèces, notamment les animaux et les champignons, expriment un nombre limité d'actines cytoplasmiques mais ont acquis une famille particulière de protéines de liaison à l'actine appelée tropomyosine. D'autres espèces, par exemple les plantes, n'expriment pas les tropomyosines, mais possèdent en revanche un grand nombre d'isoformes d'actine. Les conséquences physiologiques de l'utilisation de ces différentes isoformes d'actine, et les mécanismes moléculaires grâce auxquels ces isoformes d'actine, hautement conservées, peuvent être ségrégées spatialement sont peu connus. Au cours de ma thèse, je me suis principalement concentrée sur les mécanismes moléculaires qui pourraient conduire à cette ségrégation. En raison de la complexité de cette question chez les eucaryotes supérieurs, j'ai utilisé un système biologique simple, à savoir la levure bourgeonnante, qui est composée seulement de deux réseaux d'actine bien définis (branchés et linéaires). Ce choix peut sembler surprenant à première vue, car ce système exprime une seule actine et un ensemble limité de protéines de liaison à l'actine. Cependant, je montrerai que c'est un outil puissant pour comprendre les effets de perturbations génétiques de l'actine. J'ai créé une bibliothèque de séquences d'actine que j'ai utilisé pour remplacer le gène d’actine sauvage dans des cellules de levure. Puis, j’ai observé les conséquences de ces perturbations sur l'expression de l'actine, la prolifération cellulaire et l’organisation du cytosquelette d'actine. J'ai analysé la contribution de l'intron d'actine, l’importance d’une conservation de la séquence nucléotidique, de l’expression d’actines hétérologues, et l’effet de l’expression de deux actines dans la même cellule. Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, j'ai aussi reconstitué l'assemblage de ces structures d'actine in vitro à partir des protéines purifiées. J'ai démontré qu’un faible nombre de mutations silencieuses dans le gène de l'actine est suffisant pour changer le niveau d'expression de celle-ci, entraînant des défauts de croissance cellulaire en dessous d'un certain seuil. En exprimant des actines hétérologues, j'ai démontré que de petites variations dans la molécule d'actine sont suffisantes pour induire une réorganisation globale du cytosquelette. Alors que certains orthologues d'actine s'assemblent préférentiellement en réseaux branchés, d'autres s'assemblent préférentiellement en réseaux linéaires. Ce biais pour un réseau particulier est la conséquence d'interactions défectueuses avec une ou plusieurs protéines de liaison à l'actine, ce qui inhibe l'assemblage par l'autre voie. Il est intéressant de noter que l'expression de deux variants d'actine hétérologues, chacun spécialisé dans l'assemblage d'un réseau différent, sauve l'organisation du cytosquelette, prouvant la possibilité de séparer les fonctions de l'actine dans la levure en utilisant deux isoformes d'actine distinctes. Les souches exprimant deux actines sont également plus résistantes à la drogue CK-666, un inhibiteur de l'assemblage des réseaux branchés. Cette observation suggère que si les espèces utilisant une actine unique ont des réseaux d'actine homéostatiques, les espèces utilisant plusieurs isoformes d'actine pourraient assembler des réseaux d'actine plus indépendants. Ces résultats soulignent enfin le fait que, malgré une conservation remarquablement forte de l’actine chez les eucaryotes, ces isoformes conservent suffisamment de différences pour que des cellules en exprimant plusieurs puissent exploiter ces différences pour les séparer en réseaux d'actines distincts.

A central question in the actin field is to explain the ability of the actin molecule to assemble into different structures and perform variety of functions. From careful genome analysis of eukaryotes, it appears that species might have evolved different strategies to achieve this objective. Some species, including animals and fungi, have few cytoplasmic actins but acquired a peculiar family of actin-binding proteins called tropomyosin. Other species, such as plants, do not express tropomyosins but possess a high number of actin isoforms The physiological consequences of using different actin isoforms and the molecular mechanisms by which highly conserved actin isoforms are segregated into distinct networks, are poorly known. I was mainly focused on the molecular mechanisms that could lead to this segregation in different structures for specialized functions. Because of the complexity of this question in higher eukaryotes, I have used a simple biological system, which is budding yeast, composed of two well-defined actin networks (branched and linear). This choice may seem surprising at first glance, as this system expresses a single actin and a limited set of actin-binding proteins. However, I will show that it is a powerful way to understand its reaction to actin genetic perturbations. I created a library of actin sequences that I replaced in yeast cells to observe the consequences in actin expression, cell viability and actin network organization. I analyzed the contribution of the actin intron, nucleotide sequence, amino acid sequence and of dual expression of actins in the same cell. To gain more insight in the molecular mechanisms at play, I reconstituted the assembly of these actin structures in vitro from the same purified proteins. I demonstrated that few silent mutations in the actin gene are sufficient to modulate the level of actin expression, leading to cell growth defects below a certain threshold. At the amino acid level, I showed that small variations in the actin molecule are sufficient to induce a global reorganization of the actin cytoskeleton. While some actin orthologs assembled preferentially into branched networks, others assembled preferentially into linear networks. Biased assembly into a particular network is a consequence of defective interactions with actin-binding proteins, which inhibits assembly of the other pathway. Interestingly, expression of two heterologous actin variants, each specialized in assembling a different network, rescues cytoskeletal organization, proving the possibility to separate actin functions in yeast using two distinct actin isoforms. Strains expressing two actins are also more resistant to CK-666, an inhibitor of branched-network assembly. This observation suggests that while species using a unique actin have homeostatic actin networks, species using several actin isoforms assemble more independent actin networks. These findings highlight the fact that despite a remarkably high conservation of actin proteins across species, they retain enough differences that cells expressing multiple isoforms could exploit to segregate them into diverse actin networks.