Soutenance de thèse de Jamal SAAD

Au cours de notre Thèse, nous avons développé des approches originales permettant l'application du séquençage génomique pour le diagnostic en routine des infections humaines et animales par les mycobactéries. Ainsi, nous avons développé une nouvelle technique de séquençage génomique directement à partir des prélèvements, permettant de les enrichir en génome d’intérêt par l’utilisation de billes magnétiques. Ensuite, nous avons étudié les génomes de 92 souches de Mycobacterium tuberculosis isolées à l’IHU pendant une période de trois ans consécutifs, afin de contribuer à comprendre les causes de l’augmentation significative de l’incidence de la tuberculose pulmonaire dans la région Aix-Marseille entre 2017 et 2019. Dans ce travail, nous avons montré qu’une double polyclonalité (expansion de clones et apparition de nouveaux clones) était corrélée à cette augmentation, et aux migrations à partir des pays d’origine des patients. En parallèle, nous avons implanté le séquençage génomique comme méthode de routine pour détecter la sensibilité aux antibiotiques des isolats de M. tuberculosis, en particulier aux antibiotiquess antilépreux que les équipes de l’IHU ont avons récemment proposé de repositionner pour le traitement de la tuberculose pulmonaire. Ces différentes méthodes ont ensuite été appliquées à l’étude de la tuberculose humaine et bovine en Algérie, en Tunisie et au Cap Vert. Une partie de notre Thèse a été consacrée à la caractérisation de mycobactéries non tuberculeuses d'intérêt médical comme Mycobacterium tilburgii, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium persicum, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium shimiodae et Mycobacterium parafortuitum. En effet, nous avons réussi à séquencer le premier génome de M. tilburgii, une mycobactérie non cultivée rarement diagnostiquée chez l’homme, directement à partir d’un prélèvement par la plateforme Illumina, permettant de classifier cette mycobactérie dans le complexe Mycobacterium simiae. Également, nous avons utilisé les outils génomiques pour détecter et décrire deux nouvelles espèces de mycobactéries chez l’homme, et pour étudier la micro-diversité de certaines mycobactéries d'intérêt médical comme M. abscessus et M. ulcerans. Concernant la M. ulcerans, nous avons utilisé les génomes assemblés dans la base de données NCBI pour classifier cette espèce. En se basant sur l’analyse comparative de ces génomes, nous avons détecté un gène PPE permettant de détecter et de typer la totalité des clones dans le complexe M. ulcerans / M. marinum. Ce nouvel outil nous a permis de décrypter l’augmentation significative d’incidence de l’ulcère de Buruli en Australie. Finalement, nous avons créé une base de données par suite d’une analyse comparative de 677 génomes du genre Mycobacterium disponibles dans NCBI, nous permettant de développer dans le futur, une application facile à utiliser basée sur le séquençage à haut débit par toutes les plateformes disponibles pour identifier les espèces de mycobactéries dans des échantillons cliniques de façon rapide, sensible et efficace. Également, comme suite de nos travaux, nous avons détecte le gène « CRISPR-csm4 » comme un gène spécifique au complexe M. tuberculosis ; dont nous avons montré in silico qu’il détecte toutes les espèces du complexe M. tuberculosis dont il différencie les différentes lignées et sous-lignées. Cette découverte nous permettra de développer un nouvel outil moléculaire pour le domaine de diagnostic des infections à M. tuberculosis complex

During our thesis, we developed original approaches allowing the application of genomic sequencing for the routine diagnosis of human and animal infections by mycobacteria. Thus, we have developed a new technique of genomic sequencing directly from the samples, allowing them to be enriched with the genome of interest using magnetic beads. Next, we studied the genomes of 92 strains of Mycobacterium tuberculosis isolated at IHU between 2017 and 2019, in order to understand the causes of the significant increase in the incidence of pulmonary tuberculosis in the Aix-Marseille region. In this work, we showed that a double polyclonality (expansion of clones and appearance of new clones) was correlated with this increase, and with migrations from the countries of origin of patients. In parallel, we implemented genomic sequencing as a routine method to detect the antibiotic sensitivity of M. tuberculosis isolates, with a focus on repositioning leprosy antibiotics for the treatment of pulmonary tuberculosis. These different methods were then applied to the study of human and bovine tuberculosis in Algeria, Tunisia, and Cape Verde. Part of our Thesis was devoted to the characterization of non-tuberculous mycobacteria with medical interest such as Mycobacterium tilburgii, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium persicum, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium shimiodae and Mycobacterium parafortuitum. Indeed, we have succeeded in sequencing the first genome of M. tilburgii, an uncultivated mycobacterium rarely diagnosed in humans, directly from a sample using the Illumina platform. With a genome available, it became possible for us to classify this mycobacterium in the Mycobacterium simiae complex. We also used genomic tools to detect and describe two new species of mycobacteria in humans, and to study the micro-diversity of certain mycobacteria of medical interest such as M. abscessus and M. ulcerans. Regarding M. ulcerans, we used the genomes assembled in the NCBI database to classify this species. Based on the comparative analysis of these genomes, we have detected a PPE gene allowing the detection and typing of all the clones in the M. ulcerans / M. marinum complex. This new tool has enabled us to decipher the significant increase in the incidence of Buruli ulcer in Australia. Finally, we created a database following a comparative analysis of 677 genomes of the genus Mycobacterium available in NCBI, allowing us to develop in the future, an easy to use application based on high throughput sequencing by all platforms. This will allow the identification of mycobacteria species in clinical samples quickly, sensitively, and efficiently. Also, as a result of the work done, we detected the “CRISPR-csm4” gene as a gene specific to the M. tuberculosis complex; we have shown in silico that it detects all species of the M. tuberculosis complex and differentiates between the different lineages and sublineages. This discovery will allow us to develop a new molecular tool for the diagnostic field of infections with M. tuberculosis complex