Soutenance de thèse de PAMELA AFOUDA

L’exploration du microbiote humain a connu un tournant ces dernières années avec l’apport significatif de l’approche « microbial culturomics », une méthode de culture haut débit qui a permis d’augmenter de façon considérable le répertoire de microbes cultivables, en particulier ceux associés à l’être humain. Si cette approche a fait ses preuves dans les études de microbiote contemporain, elle n’a à ce jour jamais été appliquée à l’étude d’écosystèmes anciens. Des études précédentes sur des microbiotes portant sur des échantillons anciens et utilisant à la fois des techniques de culture et de culture-indépendantes ont révélé une richesse microbienne importante mais aussi la présence de mécanismes de résistances aux antibiotiques. Ces anciens microbiotes participent de façon importante à l’étude de l’évolution microbienne, permettant ainsi d’appréhender l’histoire des différents microbes associés aux humains de nos jours. Dans cette thèse, après une revue bibliographique résumant les caractéristiques des différentes méthodes d’études des écosystèmes microbiens anciens et leur domaine d’application aux microbiotes anciens, nous avons associé l’approche culturomics à celle de la métagénomique pour explorer la composition bactérienne d’un échantillon environnemental ancien vieux de 2,7 millions d’années : le permafrost sibérien. Nous avons identifié 28 espèces bactériennes que nous avons séquencées puis comparer à leurs homologues contemporains en analysant leurs profils de résistances et en étudiant leurs évolutions génomiques principalement par détermination de la composition en SNPs (single nucleotide polymorphism) dans les génomes. Nous avons ainsi mis en évidence que des souches du permafrost daté de 2,7 millions d’années hébergeaient de 2-51 gènes de résistances appartenant à 20 familles d’antibiotiques différentes et étaient phénotypiquement résistantes à 2-8 familles d’antibiotiques différentes. Il en ressort de l’étude génomique que la contenance génomique des souches contemporaines et anciennes étaient similaires mettant ainsi en évidence une évolution moléculaire réduite pendant 2,7 millions d’années. Dans un second travail, nous avons évalué l’impact de « la désinfection à l’éthanol » sur la composition du microbiote intestinal contemporain pouvant servir de bactériothérapie, en particulier pour traiter les infections à Clostridium difficile comme cela a été rapporté. L’application de 22 conditions de culture dont 16 de pré-enrichissement sur 11 selles de donneurs de greffes fécales préalablement désinfectées à l’éthanol a permis l’isolement de 254 espèces bactériennes majoritairement anaérobies. Parmi elles, 68 (contenant 9 nouveaux taxons bactériens) étaient absentes dans les conditions standards de culturomics pour les mêmes échantillons, soulignant le potentiel intérêt de ce procédé de désinfection pour compléter le répertoire de microbes cultivés du tube digestif. Parmi les 254 espèces bactériennes résistantes à l’éthanol, 242 n’avaient jamais été signalées en essais de bactériothérapie et représentent des candidats potentiels pour des études futures. Dans la dernière partie de ce manuscrit nous nous sommes consacrés à la description par taxono-génomique de 10 nouvelles espèces et 4 nouveaux genres bactériens obtenus durant la thèse.

The exploration of the human microbiota has been a turning point in recent years with the significant contribution of the "microbial culturomics" approach, a high throughput culture technique that has significantly increased the repertoire of cultivable microbes, particularly those associated to human being. While this approach has been proven in contemporary microbiota studies, it has never been applied to the study of ancient ecosystems. Previous studies on microbiota of ancient samples using both culture-dependent and culture-independent techniques have revealed significant microbial richness as well as the presence of antibiotic resistance mechanisms. These ancient microbiota play an important role in the study of microbial evolution, allowing us to understand the history of the different microbes associated with humans today. To start we have done a thorough review of the review literature summarizing selected articles highlighting researches based on ancient microbial ecosystems and their field of application to ancient microbiota. Then, we have combined culturomics approach with metagenomics to explore the bacterial composition of an ancient environmental sample dated to 2.7 million years old: Siberian permafrost. We identified 28 bacterial species thatwe have sequenced and then compared to their contemporary counterparts by analyzing their resistance patterns and studying their genomic evolution mainly by determining the single nucleotide polymorphism (SNPs) composition in the genomes. We found that permafrost strains dated 2.7 million years harbored two to fifty-one antibiotic resistance genes belonging to twenty different antibiotic class and were phenotypically resistant to 2-8 different antibiotic class. Genomics studies show that contemporary genomes and ancient strains were quite similar, thus revealing a reduced molecular evolution for 2.7 million years. Secondly, we evaluated the impact of "ethanol disinfection" on the contemporary intestinal microbiota's composition that can be used as bacteriotherapy, particularly to treat Clostridium difficile infections as reported. The application of twenty-two culture conditions including sixteen pre-enrichment conditions on 11 stools of faecal graft donors previously disinfected with ethanol allowed the isolation of 254 predominantly anaerobic bacterial species. Among them, 68 (containing 9 new bacterial taxa) were absent under standard culturomics conditions for the same samples, highlighting the potential interest of this disinfection process to complete the repertoire of cultured germs of the digestive tract. Of the 254 ethanol-resistant bacterial species, 242 had never been reported in bacteriotherapy trials and represent potential candidates for future studies. In the last section of this manuscript we devoted ourselves to the taxono-genomic descriptions of 10 new species and 4 new bacterial genera obtained during the thesis.