Soutenance de thèse de Lucie PISELLA

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Biologie du Développement
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
KCC2,physio-pathologie,Autisme,Regulation post-traductionnelle,Epilepsie,
Keywords
KCC2,physio-pathology,Autism,post-translational regulation,Epilepsy,
Titre de thèse
KCC2 : études phylogénétique et patho-physiologique à perspectives thérapeutiques
KCC2 : phylogenetical and physio-pathological analyss in favor of therapeutic perspectives
Date
Mardi 11 Décembre 2018 à 14:00
Adresse
Inmed UMR1249 Parc scientifique de Luminy 163 avenue de Luminy BP13 - 13273 Marseille cedex 09 - France
Conférence
Jury
Directeur de these M. Igor MEDYNA Inmed
Rapporteur M. Pascal LEGENDRE Institut de biologie Paris
Rapporteur M. Eric DELPIRE Vanderbilt university
Examinateur Mme Catherine CHIRON Hopital des enfants malade Necker
Examinateur M. Claudio RIVERA Inmed
CoDirecteur de these M. Jean-Luc GAIARSA Inmed

Résumé de la thèse

Du fondamental à la clinique, cette thèse a été construite autour d’un seul mot clefs : KCC2 et ce, grâce à plusieurs projets collaboratifs. Ce co-transporteur d’ion est une molécule à plusieurs facettes dont la multiplicité des rôles et ses implications dans diverses pathologies font d’elle un élément clef de l’organisme vivant. Sa découverte en 1996 par les Drs Payne, Stevenson et Donaldson a initié plusieurs travaux recouvrant différents domaines tels que : la physiologie, la pathologie/thérapeutique ou encore la phylogénie. L’étude physiologique de KCC2 est extrêmement vaste et bien qu’elle fasse l’objet d’une multitude de travaux, de grandes zones d’ombres sont encore présentes. KCC2 possède plusieurs rôles au sein de l’organisme. D’abord connue pour sa fonction dans la régulation de l’homéostasie de l’ion chlore comme co-transporteur, des recherches ont démontré son implication dans d’autres fonctions telles que la formation des épines dendritiques. Ces diverses fonctions sont rendues possibles par l’élaboration de différents mécanismes de régulation ciblant la protéine. Au cours d’un premier travail, sur un modèle de neurones en culture, nous avons pu définir que la phosphorylation des thréonines 906 et 1007 par la voie Wnk-Spack-Osr1 induit l’internalisation du co-tansporteur. L’état de phosphorylation de ces sites étant régulé au cours du développement ; nous avons continué ce travail en émettant l’hypothèse que que cette régulation a une importance fondamentale aux cours du développement.L’essentiel de mon projet de thèse a donc été de déterminer les conséquences physio-pathologiques d’une « hyper-phosphorylation » des thréonines 906 et 1007 au cours du développement et chez l’adulte. Pour cela nous avons créé une souris transgénique mimant l’état phosphorylé des 2 sites. Nous avons pu déterminer que la phosphorylation de ces sites induisait un retard dans l’établissement de la séquence développementale GABAergique, une altération de la balance excitation/ inhibition ainsi que des troubles comportementaux de type autistiques. Ces résultats démontrent l’implication majeure de la protéine dans l’établissement de la pathologie et place celle-ci comme cible thérapeutique. Au vu de l’implication de KCC2 dans la pathologie, trouver des activateurs du co-transporteur est actuellement devenu un défi pour les chercheurs. Au cours d’un travail collaboratif, nous avons testé la molécule CLP257 qui avait été préalablement référencée comme potentiel activateur du co-transporteur. Cependant, sur culture de lignée cellulaire après application de cette drogue nous n’avons vu aucun changement de la concentration en Cl- intracellulaire (reflet de l’activité de KCC2). La découverte d’une molécule activatrice de KCC2 pouvant être utilisée au niveau thérapeutique reste donc actuellement toujours un enjeu dans la communauté scientifique. KCC2 fait partie de la grande famille des co-transporteurs des ions chlores (CCCs). Pour mieux comprendre les propriétés fonctionnelles basales de ces transporteurs dans la lignée des métazoaires, lors d’un dernier projet collaboratif, nous avons cloné et caractérisé les CCCs provenant de l’organisme cnidérien Hydra vulgaris. Nous avons pu déterminer pour la première fois que les KCCs présents dans cet organisme avaient bien un rôle de transport du Cl-. Ces résultats ont permis d’établir d’éclairer un nouvel aspect de l’évolution de la protéine. L’ensemble de ces travaux soulignent l’importance de continué a effectué des recherches sur cette molécules afin d’éclairer les zones d’ombres qui persistent.

Thesis resume

From basic to clinical aspects, this thesis comprises different collaborative projects focussing on KCC2. KCC2 is a complex protein with multiple roles and implications in various pathologies that makes this molecule a key element of living organisms. Its discovery, in 1996 by Dr. Payne, initiated a lot of studies covering various areas such as: physiology, pathology / therapy or phylogeny. While extensively investigated, lots of aspects of KCC2 physiological roles have yet to be discovered. First identified as regulator of chloride ion homeostasis, research has demonstrated its involvement in other functions, such as the formation of dendritic spines for instance. Its various functions depend on different regulatory mechanisms targeting this protein. As a first step initiating my thesis project, we have shown, using a model of neuronal culture, that the phosphorylation of threonines 906 and 1007, by the Wnk-Spack-Osr1 pathway, induces the internalization of the co-transporter. Since the phosphorylation of these sites is regulated during development, we proposed to test the hypothesis that this regulation has a fundamental importance during development. Therefore, the main point of my thesis was to determine the physio-pathological consequences of a "hyperphosphorylation" of threonines 906 and 1007 during development and in adults. To do this, we created a transgenic mouse bearing a mutation mimicking the constitutive phosphorylation of both sites. We discovered that the phosphorylation of these sites induces a delay in the establishment of the developmental GABAergic sequence, an alteration of the excitation / inhibition balance as well as autistic-like behaviors. These results demonstrate the crucial involvement of this protein in the development of the pathologies and point this molecule as a therapeutic target. Based on KCC2's involvement in the pathology, the research of activators for this co-transporter has become a challenge for researchers. During a collaborative work, we tested the molecule CLP257 which has been previously referenced as potential activator of the co-transporter. However, on cell culture the application of this drug did not change intracellular Cl-concentration (reflect that KCC2 activity was not affected). Therefore, the discovery of an activator of KCC2 that could be used therapeutically is still an issue in the scientific community. KCC2 is part of the large family of co-transporters of chloride ions (CCCs). In order to better understand the basic functional properties of these transporters in the metazoan lineage, in collaborative project, we cloned and characterized the CCCs from the cnidian body Hydra vulgaris. We showed, for the first time, that the KCCs, present in this organism, exert a role of Cl- transporter. These results highlight a new aspect of the evolution of the protein. All these investigations point the importance to continue researches on this molecule to elucidate the persisting dark areas.