Soutenance de thèse de Valérie DELECOURT

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Génétique
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
cycle cellulaire,Syndrome de Hutchinson-Gilford,microARNs,sénescence,
Keywords
cell cycle,Hutchinson-Gilford Syndrome,senescence,microRNAs,
Titre de thèse
Progeria de Hutchinson-Gilford : rôle des microARNs dans la régulation du cycle cellulaire et de l'induction de la sénescence
Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome : role of microRNAs in cell cycle regulation and induction of senescence
Date
Mardi 29 Octobre 2019 à 14:00
Adresse
Faculté des Sciences Médicales et Paramédicales 27, Boulevard Jean Moulin 13385 Marseille CEDEX 5
Salle de visioconférences
Jury
Directeur de these M. Patrice ROLL Marseille Medical Genetics - Unité INSERM 1251
Rapporteur M. Jérôme LAMARTINE Laboratoire de Biologie Tissulaire et d’Ingénierie thérapeutique (LBTI)
Rapporteur Mme Florence SOLARI Institut Neuromyogène (INMG)
Examinateur Mme Laurence COLLEAUX Marseille Medical Genetics - INSERM U1251

Résumé de la thèse

La Progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS) est une maladie génétique rare caractérisée par un vieillissement précoce et accéléré aboutissant au décès des patients vers l'âge de 14 ans. Elle est due, dans la majorité des cas, à une mutation de novo autosomique dominante dans l’exon 11 du gène LMNA (p.G608G), responsable de la synthèse d’une protéine lamine A délétée et toxique : la progérine. Au cours du vieillissement des patients, la progérine s’accumule in vivo dans le noyau des cellules qui l’expriment, et génère de manière dose-dépendante des anomalies nucléaires à la fois morphologiques et fonctionnelles. Ces altérations conduisent à une sénescence cellulaire prématurée, en lien avec le vieillissement précoce de ces patients. Notre équipe s’intéresse aux rôles des microARNs (miRs) dans cette maladie. Les miRs sont de petits ARNs non-codants d’une vingtaine de nucléotides régulant l’expression de gènes cibles. Une étude miRNome, menée par une approche en RT-qPCR sur des fibroblastes dermiques de témoins et de patients, nous a permis d’identifier une dérégulation de l’expression de 14 miRs sur 375 miRs testés. Parmi les 8 miRs surexprimés, 7 se situent dans un cluster de miRs d’une même région chromosomique (14q32). Nous avons démontré que la progérine était responsable de la délocalisation de ce cluster chez les patients, probablement à l’origine de la surexpression de ces miRs. Nous avons choisi d’étudier 2 miRs de ce cluster, appartenant à une même famille : miR-376a-3p et miR-376b-3p. Le miR-376a-3p est décrit dans la littérature comme inhibiteur du cycle cellulaire (en ciblant notamment CDK2) et de la prolifération. Ayant la même séquence seed, ces 2 miRs pourraient avoir des effets biologiques similaires. Ils sont par ailleurs décrits comme des inhibiteurs de l’autophagie en ciblant des acteurs clés de cette voie. Au cours de ma Thèse, je me suis focalisée sur l’étude du rôle de ces 2 miRs dans le cycle cellulaire et la sénescence dans le contexte de la Progeria. J’ai montré que la transfection de ces 2 miRs (mimics) dans des fibroblastes témoins induisait une diminution de la prolifération cellulaire et de la réplication de l’ADN, ainsi qu’une augmentation du pourcentage de cellules sénescentes. J’ai montré que la surexpression de ces miRs induisait une modulation du cycle cellulaire avec une augmentation de cellules en G1/S. Au niveau protéique, je me suis particulièrement intéressée à la protéine CDK2 impliquée dans la régulation cycle cellulaire, lors de la transition de la phase G1 à la phase S. La transfection des 2 miRs entraine une diminution de l’expression de CDK2. Mes travaux actuels consistent à étudier l’impact des anti-miRs dirigés contre ces 2 miRs dans les fibroblastes de patients HGPS. La transfection de ces inhibiteurs pourrait améliorer les anomalies du cycle cellulaire, la prolifération et la réplication de l’ADN des cellules HGPS. Plus récemment, nous avons réalisé une seconde étude miRNome dans le cadre du projet plus large financé par l’AFM, incluant l’étude des ARNm et des lncRNAs (longs ARNs non-codants) par NGS (séquençage haut débit) à partir des fibroblastes dermiques et de cellules dérivées d’iPSCs (MSCs et VSMCs). Cette étude a pour objectif d’identifier des voies moléculaires communes dérégulées dans la Progeria et des syndromes génétiques apparentés (HGPS-like et Syndrome Progéroïde Atypique), permettant d’envisager à terme de mêmes approches thérapeutiques. L’analyse de ce 2nd miRNome a permis d’identifier le miR-140-5p comme un nouveau candidat très pertinent, car il cible des transcrits impliqués dans le stress oxydant (NRF2 et SIRT2) et la différenciation osseuse et adipocytaire, en lien avec les atteintes tissulaires chez ces patients. L’ensemble de mes travaux permet de mieux appréhender le rôle des miRs dans la Progeria et des syndromes apparentés, étape indispensable avant d’identifier des approches thérapeutiques nouvelles dans ces maladies au pronostic sombre.

Thesis resume

Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS) is a rare genetic disease characterized by early and accelerated aging leading to the death of patients around the age of 14. It is due, in most cases, to an autosomal dominant de novo mutation in exon 11 of the LMNA gene (p.G608G), responsible for the synthesis of a truncated and toxic lamin A protein called progerin. During patients aging, progerin accumulates in vivo in cells nuclei that express it, and generates dose-dependent nuclear abnormalities at morphological and functional levels. These alterations lead to premature cell senescence, linked to the premature aging of these patients. Our team is interested in the roles of microRNAs (miRs) in this disease. miRs are small non-coding RNAs of about 20 nucleotides regulating the expression of target genes. A miRNome study, conducted by a RT-qPCR approach on dermal fibroblasts of controls and patients, allowed us to identify a deregulation in the expression of 14 miRs out of 375 miRs tested. Among the 8 overexpressed miRs, 7 are in a miR cluster of the same chromosomal region (14q32). We have demonstrated that progerin is responsible for the relocation of this cluster in patients cells, probably causing overexpression of these miRs. We chose to study 2 miRs of this cluster, belonging to the same family: miR-376a-3p and miR-376b-3p. miR-376a-3p is described in the literature as a cell cycle inhibitor (targeting CDK2, in particular) and proliferation. By having the same seed sequence, these 2 miRs could have similar biological effects. They are also described as inhibitors of autophagy by targeting key players in this pathway. During my Thesis, I focused on studying the role of these 2 miRs in the cell cycle and senescence in Progeria context. I showed that transfection of these 2 miRs (mimics) into control fibroblasts induces a decrease in cell proliferation and DNA replication, as well as an increase in the percentage of senescent cells. I showed that the overexpression of these miRs induces a modulation of the cell cycle with an increase of cells in G1/S . At the protein level, I was particularly interested in the CDK2 protein involved in cell cycle regulation during the transition from G1 phase to S phase. Transfection of 2 miRs leads to a decrease in CDK2 expression. My current work is to study the impact of anti-miRs directed against these 2 miRs in fibroblasts of HGPS patients. Transfection of these inhibitors could improve cell cycle abnormalities, proliferation and replication of HGPS cell DNA. More recently, we performed a second miRNome study as part of the larger AFM-funded project, including the study of mRNAs and lncRNAs (long non-coding RNAs) by NGS (high-throughput sequencing) from dermal fibroblasts and derived-cells from iPSCs (MSCs and VSMCs). The aim of this study is to identify common deregulated molecular pathways in Progeria and related genetic syndromes (HGPS-like and Atypical Progeroid Syndrome), allowing the use of same therapeutic approaches. The analysis of this second miRNome has identified miR-140-5p as a new highly relevant candidate, because it targets transcripts involved in oxidative stress (NRF2 and SIRT2) and bone and adipocyte differentiation, in connection with tissue damages in these patients. All of my work provides a better understanding of the role of miRs in Progeria and related syndromes, which represents an essential step before identifying new therapeutic approaches in these diseases characterized by a poor prognosis.