Soutenance de thèse de Ana Sofia FERREIRA RAMOS

Les alphavirus comme le virus Chikungunya (CHIKV) et le virus de l'encéphalite équine vénézuélienne (VEEV) sont des arbovirus (ré)-émergents préoccupants pour la santé publique. Ces virus transmis par des arthropodes ont un génome à ARN simple brin positif d’environ 11 à 12 kilobases comportant deux cadres ouverts de lecture (ORFs). L’ORF en 5’ peut être directement traduit à partir de l’ARN génomique menant à la production des polyprotéines P123 et P1234 qui sont ensuite soumises à un clivage protéolytique pour générer les quatre protéines non structurelles : nsP1, nsP2, nsP3 et nsP4. Ce manuscrit présent le travail réalisé sur nsP1 et de coiffage des ARNm d’alphavirus et la structure/fonction de nsP3. Les alphavirus possèdent un mécanisme de coiffage de l’ARNm viral non classique catalysée par nsP1 et nsP2 qui conduit à la formation d’une structure cap-0 (m7GpppN-). La structure cap-0 est cruciale pour la réplication du virus car réduire la détection des ARN viraux étrangers, empêche la dégradation de l’ARN par exonucléase cellulaire et favorise la traduction de l’ARN viral en protéines. Par conséquent, le coiffage de l’ARNm de l’alphavirus est une cible antivirale attractive pour la conception d’inhibiteurs spécifiques. L’enzyme nsP1 catalyse trois des quatre activités essentielles requises pour le coiffage d’ARNm viral : méthylation de GTP (MTase), guanylylation de nsP1 (GT), transfert sur le 5’ l’ARNm (GTase). Un des objectifs de la thèse a consisté à développer un test de criblage permettant de détecter des inhibteurs de nsP1, pour initier une approche antivirale. Pour cela, nous avons développé un immunotest permettant de cribler à haut débit (HT) la bibliothèque de Prestwick Chemical® contre l’activité GT de nsP1. 18 composés sont ressortis ce crible et trois séries de composés ont été sélectionnées pour une caractérisation plus poussée (Ferreira-Ramos et al., 2019). Ces composés inhibent peu une MTase cellulaire, ce qui suggère leur spécificité vis-à-vis de nsP1. Des analyses de relations structure/activité (SAR) ont également été initiées pour identifier les pharmacophores actifs. D’une manière générale, les résultats montrent que notre test basé sur l’enzyme HT constitue un moyen pratique pour sélectionner des composés spécifiques ciblant le coiffage de l’ARNm des alphavirus. Parallèlement au criblage, nous avons également testé de nouveaux analogues de la série MADTP. L’organisation de nsP3 consiste en un Macro domaine au N-terminal, un domaine de liaison au zinc (ZBD) et une région hypervariable C-terminale (HVR). Le HVR joue un rôle clé dans la réplication virale en interagissant avec plusieurs partenaires parmi lesquelles des protéines à domaines SH3 ou G3BP. Le Macro domaine est essentiel aux étapes précoces et tardives de la réplication par liaison à l’ADP-ribose (ADPr) et dé-ribosylation de protéines cellulaires. Les études antérieures structure/fonction des Macro domaines permettent de classer les domaines Macro des alphavirus dans le groupe du Macro D1. Cependant, le mécanisme moléculaire de la dé-ribosylation par le Macro domaine des alphavirus reste à affiner. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, nous avons lancé une étude structurale du Macro domaine du virus Getah (GETV). La séquence du Macro domaine du GETV montre une substitution particulière dans l’un des résidus conservés dans la boucle catalytique. Compte tenu de ces observations, nous avons produit et purifié le Macro domaine du GETV pour des études cristallographiques. Nous avons caractérisé plusieurs conformations adoptées par l’ADPr dans le site de fixation. Ces diverses conformations peuvent représenter plusieurs instantanés du mécanisme de l’ADP-ribosylhydrolase, mettant en évidence de nouveaux résidus à caractériser.

Alphaviruses such as Chikungunya virus (CHIKV) and Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) are important (re-)emerging arboviruses of public health concern. These arthropod-borne viruses carry a positive single strand RNA genome with approximately 11 to 12 kilobases and is divided into two open reading frames (ORFs). The 5’ proximal ORF can be directly translated from the genomic RNA leading to the production of the P123 and P1234 polyproteins which are next subjected to proteolytic cleavage generating the four non-structural proteins: nsP1, nsP2, nsP3 and nsP4. The manuscript describes the work done on nsP1 and the alphavirus mRNA capping, and the structure/function of a domain of nsP3. Alphaviruses own an unconventional viral mRNA capping mechanism catalysed by nsP1 and nsP2 which leads to the formation of a cap-0 structure (m7GpppN-). The cap-0 structure is crucial for virus replication because it reduces the detection of foreign viral RNAs, prevents RNA degradation by cellular exonuclease, and promotes viral RNA translation into proteins. Therefore, the alphavirus mRNA capping is an attractive antiviral target for the design of specific inhibitors. The nsP1 enzyme is known to catalyse three of the four crucial activities required for the viral mRNA capping, which are: N7-guanine methyltransferase (MTase), guanylylation (GT), guanylyltransferase (GTase) activities. The GT of VEEV nsP1 can be monitored by Western blot (WB) using an antibody recognizing the cap structure (Li et al., 2015). Under the scope of this thesis a high throughput (HT) ELISA screening was developed by monitoring the GT reaction through the quantification of the m7GMP-nsP1 adduct formation. The Prestwick Chemical library® was screened using this method and the IC50 was determined for 18 hit compounds. Three series of compounds were selected for further characterization (Ferreira-Ramos et al., 2019). These compounds poorly inhibit a cellular MTase which suggests their specificity against VEEV nsP1. Analogue search and structural activity relationships (SAR) were also initiated to identify the active pharmacophore features. In general, the results show that our HT enzyme-based assay is a convenient way to select specific hit compounds targeting the viral mRNA capping of Alphaviruses. In parallel to the screening we also tested new analogues from MADTP series by WB. The organization of nsP3 consists in a Macro domain at the N-terminal, a zinc binding domain (ZBD) and a C-terminal hypervariable region (HVR). The HVR plays a key role in the viral replication by interacting with several partners among which G3BP and SH3 containing proteins. The Macro domain is essential at both early and late steps of the replication through ADP-ribose (ADPr) binding and de-ribosylation of cellular proteins. Previous structural and sequence analysis together with functional characterization could classify alphavirus Macro domains into a group prototyped by Macro D1. However, the molecular mechanism of de-ribosylation by alphavirus Macro domain remains to be built up. In order to better understand this mechanism, we initiated a structure-based study of Getah virus (GETV) Macro domain. The sequence of GETV Macro domain shows a peculiar substitution in one of the conserved residues in the catalytic loop. Given these observations, we produced and purified the GETV Macro domain for crystallographic studies and characterized several conformations adopted by ADPr in the binding site. Together, these various conformations observed in the crystallographic structures may represent several snapshots of the ADP-ribosylhydrolase mechanism, highlighting new residues to be further characterised.