Soutenance de thèse de Robert SEUTE

KCNN4 est un transporteur de K+ qui présente une large distribution tissulaire. Bien que sa fonction soit bien décrite dans le globule rouge (GR), son rôle pendant l’érythropoïèse est inconnu. Nous avons étudié l'expression et la fonction de KCNN4 pendant l'érythropoïèse humaine afin d'évaluer le rôle du transport de K+ dans la production de GR. Nous avons comparé deux protocoles de différentiation couramment utilisés et sélectionné la culture liquide en 4 phases pour sa différenciation érythroïde synchronisée, sa durée prolongée de la différenciation terminale, son taux élevé d’énucléation et le profil d’expression de KCNN4. Un test fonctionnel basé sur la cytométrie en flux a été conçu pour évaluer l'activité de KCNN4, afin de valider des approches d’inactivation génique (KO). Nous avons mesuré une augmentation de l’efflux de K+ dépendant de KCNN4 au cours de la différenciation terminale, en accord avec l'augmentation de l'expression de KCNN4. Nous avons étudié le rôle de KCNN4 pendant l'érythropoïèse en utilisant des approches de KO et de surexpression. Les cellules KCNN4 KO avaient un retard de différenciation au stade progéniteurs et une accélération aux stades terminaux, associés à une dérégulation de plusieurs gènes impliqués dans le cycle cellulaire. De plus, les réticulocytes KCNN4 KO étaient résistants à la déshydratation en présence de l'activateur de Piezo1, Yoda1, confirmant l'absence de KCNN4 à leur surface. La surexpression de KCNN4 recombinant était associée à une augmentation de l'expression de la calmoduline, confirmant l’adressage efficace de KCNN4 recombinant à la membrane, mais n'a pas montré d'impact sur la prolifération et la cinétique de différenciation en conditions physiologiques.

KCNN4 is a K+ transporter with a broad expression pattern. KCNN4 function is well described in circulating red blood cells (RBCs) but little is known about its role during erythropoiesis. We studied the expression and function of KCNN4 during human erythropoiesis to assess the role of K+ transport in RBC production. We performed a comparative study of 2 routinely used protocols and selected the 4-phase liquid cell culture for its features related to synchronized erythroid differentiation, prolonged duration of terminal differentiation, high enucleation, and high KCNN4 gene expression. A flow cytometry-based functional assay was designed to monitor KCNN4 activity, to validate subsequent knock-out (KO) approaches. We found that KCNN4-dependent K+ efflux increased progressively through terminal differentiation, consistent with the increased KCNN4 gene expression. We studied the role of KCNN4 during erythropoiesis using KO and overexpression approaches. KCNN4 KO cells showed delayed differentiation at the progenitor stage and acceleration at the terminal stages, underscored by modifications in gene expression of several proteins involved in cell cycle dynamics. In addition, KCNN4 KO reticulocytes were resistant to dehydration when treated with the Piezo1 activator Yoda1, confirming the total absence of KCNN4 in these cells. Overexpression of recombinant KCNN4 was associated with increased calmodulin expression at the cell surface, confirming the correct delivery of recombinant KCNN4 to the membrane, but had no impact on proliferation and differentiation kinetics under resting conditions.