Soutenance de thèse de Laurine BINET

Les cellules B du Centre Germinatif (CG) se différencient en plasmocytes (PC) pour induire une protection à long terme via la production d’anticorps (Ac). Les étapes de la différenciation, d’une cellule B activée en PC en passant par l’état plasmablaste (PC), a longtemps été étudié à travers des stimulations de cellules B naïves ou mémoires in vitro. Les états intermédiaires reliant les B du CG et les PC dans les ganglions lymphatiques drainants (draining Lymph Nodes, dLN) restent peu caractérisés du fait de leur rareté et du manque de marqueurs d’identification robustes. Nous utilisons un modèle murin de traçage cellulaire (Aicda-Cre-ERT2+/- x Rosa26-lox-STOP-lox-eYFP+/-) avec une immunisation avec un antigène modèle. En combinant l’analyse en cellule unique du phénotype, transcriptome et répertoire BCR des cellules B du CG et PC sortis récemment du CG, nous avons identifié des pPrePC putatifs qui expriment des marqueurs nous permettant de les enrichir par FACS. Les PrePC ont un phénotype mixé entre CG (CD19hi B220+ GL7+) et PC (CD138lo IRF4hi) et représentent seulement 0.08% des cellules B totales commutées à jour 12 à 15 après immunisation. Les PrePC sont en cycle, et expriment Ki67, ainsi que des transcrits reliés à la présentation antigénique via le CMH de classe II. Les PrePC expriment également une signature de stress réticulaire, et sont engagés dans la production en Ac spécifiques de l’antigène utilisé. En effet, ils peuvent sécréter des niveaux détectables d’Ac ex vivo sans re-stimulation. Ils sont intégrés dans un continuum de différenciation entre B du CG et PC et apparaissent hétérogènes dans leur profil de mutation du BCR. Enfin, les PrePC peuvent être divisés entre des cellules activées et des cellules plutôt quiescentes, qui témoignent de différents stades au cours de la différenciation. Les PrePC expriment des marqueurs de sortie des CG et d’orientation des cellules vers la medulla et la moelle osseuse. Nous avons utilisé des techniques de microscopie confocale et avons retrouvé un enrichissement des cellules venant du CF et étant engagées dans la différenciation en PC (exprimant IRF4) autour de la zone sombre DZ à l’extérieur du CG. Grâce à des expériences de transcriptomique spatiale, nous avons pu détecter deux zones : la GTI (zone interface entre la zone T et le CG, GC-T zone interface) et la GMI (zone interface entre la medulla et le CG, GC-Medulla interface). La GMI semble préférentiellement enrichie en cellules IRF4hi venant du CG. Par la suite, nous avons réalisé des expériences de microscopie 3D en utilisant la technologie lightsheet pour identifier in continuum entre la GMI et la medulla. Ce continuum est présent pour chaque CG à une certaine profondeur du dLN et est entouré de cellules stromales médullaires. Dans l’ensemble, nos résultats intriduisent une stratégie afin d’enrichir et isoler les PrePC. Nous avons pu réaliser une description fine du continuum d’états reliant les B du CG et les PC à des niveaux phénotypiques, transcriptomiques et de répertoire BCR. Nous faisons l’hypothèse qie ces états intermédiaires précoces pourrons aider à l’étude des facteurs intrinsèques et extrinsèques menant à la différenciation en PC. De plus, nos données introduisent la GMI comme la route majeure de sortie des PC venant du CG et comme les faisant maturer.

Germinal centre (GC) B cells differentiate into plasma cells (PC) to induce long-term protection via the production of antibodies (Ab). The stages of differentiation, from activated B cell to PC via the plasmablast (PB) stage, have long been studied by stimulating naïve or memory B cells in vitro. The intermediate states bridging GC B cells and PCs in draining lymph nodes (dLNs) remain poorly characterised due to their scarcity and the lack of robust identification markers. We used a lineage tracing mouse model (Aicda-Cre-ERT2+/- x Rosa26-lox-STOP-lox-eYFP+/-) with an immunization with a model antigen. By combining single-cell analysis of the phenotype, transcriptome and BCR repertoire of GC B cells and PC recently derived from the GC, we identified putative PrePC expressing markers that allowed us to enrich them by FACS. PrePC have a mixed phenotype between GC B cells (CD19hi B220+ GL7+) and PC (CD138lo IRF4hi) and represent only 0.08% of total live switched B cells between days 12 to 15 after immunization. PrePC cycle and express Ki67, as well as transcripts linked to antigenic presentation via MHC class II. PrePC also express a reticular stress signature and are involved in the production of antigen-specific Ab. In fact, they can secrete detectable levels of Ab ex vivo without re-stimulation. They are integrated in a continuum of differentiation between GC B cells and PC and appear heterogeneous in their BCR mutation profile. Finally, PrePC can be divided into activated and quiescent cells, reflecting different stages of differentiation. PrePCs express markers of their exit from GC and orientation towards the medulla and bone marrow. We used confocal microscopy techniques and found an enrichment of cells coming from the GC and engaged in PC differentiation (expressing IRF4) around the DZ outside of the GC. Using spatial transcriptomics experiments, we were able to detect two zones: the GTI (GC-T zone interface) and the GMI (GC-Medulla interface). The GMI appears to be preferentially enriched in IRF4hi cells from the CG. Subsequently, we performed 3D microscopy experiments using lightsheet technology to identify a continuum between the GMI and the medulla. This continuum is present for each CG at a certain depth of the dLN and is surrounded by specific medullary stromal cells. Overall, our results suggest a strategy for enriching and isolating PrePC. We were able to provide a detailed description of the continuum of states linking GC B cells and PC at phenotypic, transcriptomic and BCR repertoire levels. We hypothesize that these early intermediate states may help to study the intrinsic and extrinsic factors leading to PC differentiation. In addition, our data introduce the GMI as the major exit and maturation route for GC-derived PC.