Soutenance de thèse de Mariem SOUISSI

Dans l'adhésion cellule-cellule ou l'adhésion à la matrice extracellulaire (ECM), les cellules s'accrochent les unes aux autres ou à la ECM qui relie les cellules voisines. Dans le cas de l'adhésion cellule-matrice, les intégrines se regroupent et forment des structures spécialisées appelées adhésions focales (FAs). Les FAs sont des importantes structures mécanosensibles constituées d'intégrines qui couplent mécaniquement le cytosquelette d'actomyosine à la ECM. L'objectif à long terme de notre projet est de comprendre les liens entre la force de l'actomyosine, la régulation de l'intégrine et les propriétés de la ECM. Une façon d'aborder ce problème est d'utiliser une approche bottom-up qui consiste à reconstituer un complexe d'adhésion minimal afin de disséquer le rôle de chaque composant. Ici, nous avons développé deux systèmes membranaires modèles différents : les vésicules géantes unilamelaires (GUVs) qui contiennent des intégrines dans leur membrane et le deuxième est les vésicules géantes de la membrane plasmique (GPMVs) dérivés des cellules. Les GUVs imitent la membrane cellulaire de manière très simplifiée.Les GUVs ont été largement utilisés pour étudier l'adhésion cellulaire, mais souvent en utilisant des liens non physiologiques, en raison de la difficulté d'incorporer des protéines transmembranaires dans des membranes modèles. Nous avons optimisé un protocole, basé sur les travaux antérieurs, pour fabriquer des GUVs incorporant la protéine transmembranaire, intégrine. Nous avons développé ici un nouveau protocole pour la fabrication de GUV porteurs d'intégrine en utilisant la technique de gonflement assistée par PVA. Dans une étape intermédiaire, nous avons fabriqué et caractérisé de petits protéoliposomes contenant des intégrines (integrin-containing small proteoliposomes, pSUV), en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM) et la diffusion de la lumière (light-scattering). Nous avons ensuite utilisé ces pSUV pour fabriquer des protéines contenant des GUVs (pGUVs), que nous avons caractérisés par microscopie optique. Nous avons vérifié la fonctionnalité des intégrines dans les pGUVs en étudiant l'adhérence des pGUVs sur différents substrats fonctionnalisés avec RGD, un ligand extracellulaire de l'intégrine. Ensuite, nous avons étudié la partie intracellulaire des intégrines. Nous savons que l'intégrine possède un domaine intracellulaire qui se lie à la taline, une protéine régulatrice intracellulaire de l'intégrine, en plus du domaine extracellulaire qui est lié aux ligands présents dans le microenvironnement cellulaire. Dans la membrane des GUVs, les intégrines sont orientées de manière aléatoire. Les GUVs adhèrent à la surface fonctionnalisée avec RGD via les intégrines qui exposent leur domaine extracellulaire à l'extérieur des GUVs. Nous avons observé que la taline ne se lie pas à ces GUVs. Ensuite, nous avons éclaté les GUVs adhérents pour exposer le domaine intracellulaire des intégrines liées qui étaient inaccessibles à l'intérieur des GUVs, et nous avons observé que la taline colocalise en partie avec l'intégrine. Cette observation suggère que l'intégrine doit être liée à son ligand extracellulaire (ici RGD) afin de lier la taline. Bien que le gonflement assisté par PVA de GUVs contenant des intégrines purifiées se soit révélée utile, la technique n'est pas très stable et nécessite la purification des intégrines. Nous avons donc mis en place un autre système de membrane modèle, les GPMVs à partir de cellules. On s'attend à ce que ces GPMVs contiennent des intégrines dans leurs membranes, puisqu'elles sont fabriquées à partir de membrane cellulaire réelle. Cependant, plusieurs améliorations du protocole étaient nécessaires avant que les GPMVs contenant des intégrines puissent être récoltés de manière fiable. Nos découvertes offrent de nouvelles connaissances sur l'optimisation de la synthèse de GPMVs à partir de différents cellules sur la conservation des protéines transmembranaires.

Living cells interact with their surroundings via the cell membrane. The cell membrane mediates adhesion, essential for many life processes. In cell-cell adhesion or extracellular matrix adhesion, cells cling to one another or to the extracellular matrix that links nearby cells. In case of cell to matrix adhesion, integrins are often the proteins that are implicated. In many cells, integrins cluster and form specialized structures called Focal adhesions (FAs). FAs are important mechanosensitive structures that consist of clustered integrins that mechanically couple the actomyosin cytoskeleton to the extracellular matrix (ECM) via actin binding proteins (ABPs). The long-term objective of our project is to understand the links between actomyosin force, integrin regulation and ECM properties, which underlies FA mechanosensitivity. One way to approach this problem is via bottom-up reconstitution of a minimal adhesion complex in order to dissect the role of each component. Here, we developed two different model membrane systems: the first is GUVs (Giant Unilamellar Vesicles) that carry integrins in their membranes, and the second is GPMVs (Giant Plasma Membrane Vesicles) derived from cellular blebs that carry integrins. GUVs mimic the cell membrane in a highly simplified way. GUVs have proved to be indispensable for understanding the biochemistry and biophysics of membrane-bound proteins. They were extensively used to probe cell adhesion, but often using non-physiological linkers, due to the difficulty of incorporating transmembrane proteins into model membranes. Here we optimized a protocol, based on the earlier work, %of Streicher et al, for making GUVs incorporating the transmembrane protein integrin. While earlier, the electroswelling technique was used, here we developed a new protocol for fabrication of integrin carrying GUVs using the PVA-assisted swelling technique. The latter is a newer technique that removes many drawbacks of the former, such as restriction on the swelling buffer, and is also quicker and easier to use. As an intermediate step, We fabricated and characterized integrin-containing small proteoliposomes (pSUVs), using Transmission Electron Microscopy (TEM) and light-scattering. We then used these pSUVs to make protein containing GUVs (pGUVs), that we characterized by optical microscopy. Next, we verified the functionality of the integrins in the pGUVs by studying the adhesion of the GUVs on different substrates functionalized with RGD, an Extracellular Matrix (ECM) ligand of integrin. Next, we turned to the intracellular side of the integrins. We know that integrin has an intracellular domain that binds to talin, an intracellular regulatory protein of integrin, in addition to the extracellular domain that is linked to ligands present in the cell microenvironment. In GUVs, integrins are randomly oriented in the membrane. GUVs adhere to RGD functionalized surface via the integrins that expose their extracellular domain outside the GUVs. We observed that talin does not bind to these GUVs. Next, we burst the adhered GUVs to expose the intracellular domain of the bound integrins that were inaccessible inside the GUVs, and we observed that talin partly colocalizes with integrin. This observation hints that an integrin needs to be bound to its extracellular ligand in order to bind talin. Even though PVA-assisted swelling of GUVs containing purified integrins proved to be useful, the technique is not very stable and necessitates purification of integrins. We therefore put in place another model membrane system, which is giant plasma membrane vesicles (GPMVs). These GPMVs are expected to contain integrins in their membranes, since they are made from real cell membrane. However, several improvements to the protocol were needed before integrin containing GPMVs could be reliably harvested. Our findings offer important new knowledge on the optimization of GPMV synthesis and the retention of transmembrane proteins.