Soutenance de thèse de Cécilia LUCIANI

Les plaques de Peyer (PP) situées dans l’intestin grêle sont les principaux sites de surveillance immunitaire de la lumière intestinale. Ces sites possèdent des cellules dendritiques dérivées de monocytes appelées LysoDC qui sont capables d'échantillonner la lumière intestinale en formant des dendrites à travers des cellules épithéliales spécifiques des PP, les cellules M. Les LysoDC matures ont la capacité après stimulation de migrer au niveau des régions inter-folliculaire (IFR) afin d’entrer en contact avec des LT naïfs pour les activer. Lors de nos travaux de thèse, nous avons montré qu’à la différence des cellules dendritiques conventionnelles de type 2 (cDC2) dépendantes de la chimiokine CCR6, le recrutement et la différentiation des LysoDC dépendent de la chimiokine CCR2 mais pas de CX3CR1 qu’elles expriment pourtant fortement. Nous avons aussi montré que la survie et la différentiation des LysoDC requièrent la présence des facteurs RANKL et CSF1, tous deux exprimés par les cellules stromales sous-épithéliale. Cependant, contrairement à la délétion du CSF1 qui n’impacte que les cellules dérivées de monocytes, LysoDC et macrophages, l’inhibition de la signalisation RANK impacte en plus les cDC. Si cette déplétion des cDC semble indirecte, une délétion spécifique de RANK dans les cellules dérivées de monocytes nous a permis de démontrer l’effet direct de RANK sur la survie des LysoDC. En parallèle, nous avons mis au point une méthode de déplétion chimique des monocytes circulants et donc des précurseurs monocytaires sanguins des LysoDC afin d’étudier leur rôle dans la réponse immunitaire intestinale in vivo. Ce traitement chimique induit une déplétion bien plus prolongée des LysoDC que des macrophages, ce qui suggère que ces 2 populations pourraient dérivées de précurseurs monocytaires distincts. En comparant la cinétique de déplétion et de rétablissement des monocytes circulants après traitement chimique avec celles des LysoDC et des LysoMac, nous avons de plus observé que la cinétique de rétablissement des LysoMac mais pas des LysoDC était corrélée avec celle des monocytes majoritaires exprimant Ly6C, connus pour donner naissance aux macrophages résidents dans les tissus. De plus, nous avons montré que la déplétion de la deuxième population monocytaire la plus importante qui exprime CD43 mais pas Ly6C n’a aucune incidence sur le recrutement des LysoDC dans les PP. Par contre, nous avons identifié comme candidat précurseur potentiel des LysoDC une autre population monocytaire très minoritaire, n'exprimant pas les marqueurs monocytaires classiques Ly6C et CD43 mais possédant la même cinétique de rétablissement que les LysoDC. Nous avons procédé à la purification de ces précurseurs potentiels et des autres populations monocytaires en parallèle de celle des LysoDC afin de pouvoir comparer leur profil transcriptionnel par scRNAseq. Comme notre étude a permis d’identifier CCR2 parmi les marqueurs clés permettant de suivre les précurseurs de LysoDC in vivo, nous avons donc utilisé un modèle de souris transgénique permettant de suivre les cellules CX3CR1+ exprimant CCR2 par expression conditionnelle de la GFP après traitement au tamoxifène. Ce traçage de la destinée cellulaire des monocytes CX3CR1+CCR2+ nous a permis de suivre la différenciation des LysoDC au sein de la PP. Nous avons pu observer dès 48h après traitement au tamoxifène, la présence de cellules CCR2+ au contact des veinules à endothélium épais proches de la séreuse et de l’IFR, puis, 2 jours plus tard, une localisation subépitheliale de ces cellules exprimant les marqueurs typiques des LysoDC tels que CD11c, Sirp alpha et embigine mais pas CD4, un marqueur des macrophages dans l’intestin. En conclusion, mon projet de thèse a permis d’identifier et caractériser une population rare de monocytes Ly6C-CD43-CX3CR1+CCR2+ comme précurseur potentiel des LysoDC mais aussi d’identifier la niche des LysoDC responsable de leur survie et de leur différenciation.

Peyer's patches (PP) of the small intestine are the main sites of immune surveillance of the intestinal lumen. These sites contain dendritic cells called LysoDC, which are able to sample the intestinal lumen by forming dendrites through specialized epithelial cells of PP, the M cells. When stimulated, mature LysoDC have the ability to migrate to the interfollicular regions (IFRs) and interact with naive LTs to prime them. We have shown that unlike conventional type 2 dendritic cells (cDC2), which are dependent on the chemokine CCR6, the recruitment and differentiation of LysoDCs require the chemokine CCR2, but not CX3CR1, although they strongly express the latter. In addition, we have shown that the survival and differentiation of LysoDCs in PP require the presence of the factors RANKL and CSF1, both of which are expressed by subepithelial stromal cells. However, unlike CSF1 deletion, which only affects the monocyte-derived cells, LysoDCs and macrophages, RANK inhibition also affects cDCs. While this depletion of cDCs appears to be indirect, we were able to demonstrate a direct effect of RANK on LysoDC survival by specifically deleting RANK in monocyte-derived cells. In parallel, we have developed a method to chemically deplete circulating monocytes, and thus blood monocyte precursors of LysoDC, to study their role in the intestinal immune response in vivo. This chemical treatment induces a much more prolonged depletion of LysoDCs than of macrophages, suggesting that these 2 populations may derive from different monocyte precursors. By comparing the depletion and recovery kinetics of circulating monocytes after chemical treatment with those of LysoDC and LysoMac, we further observed that the recovery kinetics of LysoMac, but not LysoDC, correlated with those of the main monocyte subset expressing Ly6C, which is known to give rise to resident macrophages in tissues. We also showed that depletion of the second largest population of monocytes expressing CD43 but not Ly6C did not affect the recruitment of LysoDCs to the PP. In contrast, we identified another tiny monocyte population as a potential LysoDC precursor candidate, which does not express the classical monocyte markers Ly6C and CD43, but has the same recovery kinetics as LysoDCs. We purified this potential precursor and other monocyte subsets in parallel with LysoDCs to compare their transcriptional profiles by scRNAseq. As our study identified CCR2 as one of the key markers for tracking LysoDC precursors in vivo, we used a transgenic mouse model to track CCR2-expressing CX3CR1+ cells by conditional expression of GFP after tamoxifen treatment. This fate-mapping model of CX3CR1+CCR2+ monocytes allowed us to follow the differentiation of LysoDCs within PPs. As early as 48 hours after tamoxifen treatment, we observed the presence of CCR2+ cells in contact with high endothelial venules close to the serosa and the IFR, and then, 2 days later, a subepithelial localisation of these cells expressing typical LysoDC markers such as CD11c, Sirp alpha and embigin, but not CD4, a marker of intestinal macrophages. In conclusion, my PhD project allowed the identification and characterisation of a rare population of Ly6C-CD43-CX3CR1+CCR2+ monocytes as potential precursor of LysoDCs, but also the identification of the LysoDC niche responsible for their survival and differentiation.