Soutenance de thèse de Michel ALHOSNY

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Maladies Infectieuses
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Génomique,Dysbiose,Entérocolite Nécrosante,Clostridium butyricum,Pied Diabétique,Taxonogénomique
Keywords
Genomics,Dysbiosis,Necrotizing Enterocolitis,Clostridium butyricum,Diabetic Foot,Taxono-genomics
Titre de thèse
Les Maladies Associées à la Dysbiose Explorées par Analyse Génomique
Dysbiosis-Associated Diseases Explored with Genomic Analysis
Date
Jeudi 22 Novembre 2018 à 11:00
Adresse
Institut Hospitalo-Universitaire - Méditerranée Infection, 19-21 Boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05, France.
Salle 01
Jury
Directeur de these Bernard LA SCOLA Université d'Aix-Marseille
Rapporteur Jean-Philippe LAVIGNE Université de Montpellier-Nîmes
Rapporteur Tu Anh TRAN Université de Montpellier-Nîmes
Examinateur Folrence FENOLLAR Université d'Aix-Marseille

Résumé de la thèse

La dysbiose s’avére une cause majeure de la survenue de diverses maladies, en favorisant la translocation des bactéries pathogènes, induisant l'incorporation du processus inflammatoire dans l’écosystème du microbiote. L’entérocolite nécrosante (ECN) et l’infection du pied diabétique (IPD) demeurent deux modèles de maladies associées à la dysbiose dans lequel différents microorganismes spécifiques ont été décrits. De ces faits, émerge la nécessité d’évaluer et d’étudier cette potentielle relation. Cela est devenue possible grâce à l’arrivée des nouvelles approches d'analyse génomiques (AG). Concernant l’ECN, cette technique a été utilisé en association avec la culture bactérienne, la qRPC ciblée, la mutagénèse génétique et la cytotoxicité cellulaire pour évaluer la relation entre C. butyricum et l’ECN. Une étude de cohorte a été menée dans le Sud-Est Français, sur des échantillons de selles de nouveau-nés prématurés et hospitalisés dans plusieurs unités de soins intensifs néonatals (USIN). Isolée par culture ciblée, C. butyricum demeure l’espèce la plus fréquente chez des patients à ECN. En combinant la culture et la qRPC, nous avons confirmés une prévalence significative du C. butyricum chez les patients par rapport aux contrôles. L'AG du C. butyricum a révélé la présence de clusters liés géographiquement et/ou en fonction du temps. Le portage asymptomatique peut-être suggéré dû à la présence d’une similarité génomique des souches patients et contrôles. De plus, l’identification des gènes codant pour l'hémolysine et les souches C. butyricum sélectionnées des différents clusters ont montré un effet cytotoxique sur les cellules Jurkat. La présence d’un effet cytotoxique sur les cellules Caco-2 a orienté l’étude vers le mécanisme d'entérotoxicité. L’effet toxique persistait, malgré la mutagenèse induite sur la β-hémolysine. En se basant sur les données physico-chimiques générés par fractionnement du surnageant, nous avons suggéré que la fraction évaluée est protéique, par une entérotoxicité sur la fraction plus grande que 30 KDa et une diminution remarquable de l’effet de cette dernière après inactivation. Une protéine codant pour PspC family transcriptional regulator, était uniquement identifié par analyse FPLC et nano-LC-MS/MS sur la même fraction. Cette protéine possédait un motif glucan-binding protein commun avec celui de la toxine A/B du C. difficile et l'autolysine du S. pneumoniae. L’inactivation du gène identifié présentait un effet entérotoxique, suggérant la présence de différents et/ou une combinaison de gènes associés à la toxine. En parallèle, nous avons ciblé l’impact du C. neonatale dans la survenue de l’ECN. La qRPC spécifique rpoB pour identification du C. neonatale nous a montré que cette espèce était plus fréquente chez les patients, bien que co-identifiée avec la présence du C. butyricum. De même, l’identification des clones géographiquement liées sur des isolats locaux, en particulier chez les souches isolées de la même USIN. En effet, des séquences d'hémolysine ont été identifiées, ainsi la superfamille pathogène GNAT de l'acétyltransférase était uniquement détectée dans deux groupes mais pas dans l’autre. Ces données suggèrent la présence d’un mécanisme similaire au celui des infections à C. difficile. La stratégies WGA a été utilisée pour évaluer des souches S. aureus et E. coli isolées de l’IPD. Nous avons impliqué l’analyse de polymorphismes nucléotidiques, pour cibler les mutations induites au sein des gènes spécialement ceux qui codent pour des facteurs de virulences. De plus, l’approche taxonogénomique a été utilisée pour caractériser de nouvelles espèces bactériennes isolées du projet culturomique. Enfin, ces résultats contribueront fortement aux études futures et aux applications cliniques dans le but de déchiffrer le lien entre l'apparition de maladies liées à la dysbiose et des microorganismes spécifiques, afin de mieux comprendre leurs mécanismes physiopathologiques et les traitements ciblés.

Thesis resume

Dysbiosis remains a main cause during the establishment of several diseases, by promoting pathogenic bacterial translocation, leading to the incorporation of inflammatory process within microbiota eco-system. Specific microorganisms were involved in the pathogenesis of dysbiosis-associated diseases, notably necrotizing enterocolitis (NEC) and diabetic foot (DF). From this, emerges the need to describe plausible relationship between diseases-associated microorganisms. This was possible by the implication of whole-genome analysis (WGA) approaches. Genomics analysis was combined with culture, targeted qPCR, genetic engineering and cytotoxicity to study the relationship between C. butyricum and the occurrence of NEC. A cohort was conducted in French South-East region, on matched preterm neonates stool samples and hospitalized in several neonatal intensive care unit (NICU). Culture showed that C. butyricum was the most frequently isolated species from NEC among Clostridia. By combining targeted culture and qPCR, we also showed a prevalence of C. butyricum significantly higher in NEC than controls. C. butyricum WGA revealed geographical and/or temporal clusters, thus genomic relationship between NEC-associated isolates and controls, suggesting the presence of asymptomatic carriage. Additionally, genes encoding for hemolysin were detected and C. butyricum supernatants from all clusters exhibited cytotoxic effect on Jurkat cells. Cytotoxic effect was also present on Caco-2 cell line, which directed the study towards the enteropathogenicity hypothesis. Supernatant of β-hemolysin-mutant C. butyricum showed enterotoxic effect. Based on physico-chemical data generated from fractioned supernatant, we assumed that the evaluated fraction was a protein, since enterotoxic activity was for the fractions greater than 30 KDa. Inactivation by heating-based tests confirmed our findings. FPLC and nano-LC-MS/MS performed on the same detected fraction revealed that PspC family transcriptional regulator was the unique cytotoxic protein identified. This protein owned a glucan-binding domain, shared by C. difficile toxin A/B and S. pneumoniae autolysin. Genetic knock-out of PspC protein was cytotoxic on Caco-2 cells, suggesting by this the existence of different and/or the combination of encoding genes. In another study, we managed to explore the potential relationship between C. neonatale and NEC. Specific rpoB-based qPCR was developed to identify C. neonatale directly from patients’ samples. We found that, C. neonatale was more prevalent in NEC than in controls. Although co-identified in association with C. butyricum, C. neonatale showed lower abundance. In parallel, three geographic-related clonal lineage of C. neonatale were distinguished using WGA, especially in NEC-associated strains isolated from the same NICU. Hemolysin sequences were also identified. Furthermore, GNAT superfamily of acetyltransferase was the unique pathogenic family identified within two clusters, although not detected in the other cluster. These data suggest a mechanism similar to that of C. difficile infections, linked to antibiotics administration and toxin-producing species. Regarding to DF infection, single-nucleotide polymorphisms were used to study genomics evolution of S. aureus and E. coli, targeting the identification of mutations in coding regions, especially within virulent genes. Furthermore, taxonogenomics approach was used to characterize new bacterial species isolated from culturomics project. Finally, these results will highly contribute to the future studies and clinical application to decipher the occurrence of dysbiosis-linked diseases and their linkage to specific microorganism, in order to better understand its mechanism of physiopathology and targeted treatments.