Soutenance de thèse de Romy COHEN

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Neurosciences
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Anticorps à domaine unique,Barrière hémato-encéphalique,Adressage au cerveau,Transcytose,
Keywords
Single domain antibody,Blood-brain barrier,Brain targeting,Receptor-mediated transcytosis,
Titre de thèse
Développement d’anticorps à domaine unique comme vecteurs ciblant des récepteurs impliqués dans la transcytose et traversant la barrière hémato-encéphalique pour l’adressage d’agents d’imagerie et thérapeutiques vers le cerveau.
Novel single domain antibody-based vectors cross the blood-brain barrier via receptor-mediated transcytosis for brain delivery of imaging or therapeutic agents.
Date
Mercredi 19 Septembre 2018 à 14:30
Adresse
Faculté de Médecine secteur Nord 51 boulevard Pierre Dramard 13015 Marseille
Salle des thèses
Jury
Directeur de these Michel KHRESTCHATISKY Aix-Marseille Université
CoDirecteur de these Daniel BATY Aix-Marseille Université
Examinateur Françoise DIGNAT-GEORGE Aix-Marseille Université
Rapporteur Pierre MARTINEAU Université de Montpellier
Rapporteur Marie-Pierre DEHOUCK Université d'Artois
Examinateur Nathalie PARDIGON Institut Pasteur Paris

Résumé de la thèse

La prévalence des pathologies du système nerveux central (SNC) augmente et l’aire thérapeutique du SNC est l’un des principaux marchés pharmaceutiques. Cependant, l'efficacité thérapeutique de la grande majorité des molécules développées pour traiter ces pathologies n’est pas optimale en raison des caractéristiques anatomiques et physiologiques uniques de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Celle-ci joue un rôle de protection majeur en contrôlant les flux de molécules, limitant considérablement la distribution cérébrale d'agents pharmacologiques. Divers systèmes de transport permettent néanmoins le passage des nutriments essentiels au fonctionnement du SNC, parmi lesquels se trouve la transcytose régulée par des récepteurs (RMT). Le détournement de ce système physiologique pour délivrer des agents pharmacologiques dans le cerveau, par une stratégie communément comparée à celle du « Cheval de Troie », est considéré comme une voie prometteuse. Cette stratégie implique la conjugaison d’agents pharmacologiques à des molécules vecteurs développées pour cibler spécifiquement des récepteurs présents au niveau de la BHE et impliqués dans des processus de RMT. Nous avons eu pour objectif au cours de ce projet de développer de nouveaux vecteurs sous forme d’anticorps à domaine unique de lama (single domain antibodies, sdAbs), spécifiques de trois récepteurs exprimés au niveau de la BHE : les récepteurs LRP8, TfR et SRB1. La première partie du projet a consisté à immuniser un lama avec des préparations membranaires de cellules exprimant les trois récepteurs, sous leur forme humaine et souris, afin de favoriser la production d’anticorps à reconnaissance croisée. Une banque de phages présentant les sdAbs a ensuite été construite et utilisée pour réaliser différentes stratégies de sélection par phage display. A l’issue d’étapes de criblage, les sdAbs sélectionnés (9 anti-LRP8, 4 anti-TfR, 11 anti-SRB1) ont été produits et caractérisés (affinités pour les récepteurs, compétitions avec les ligands naturels). Dans une deuxième partie, nous avons évalué le potentiel des sdAbs les plus prometteurs en tant que vecteurs. Pour ce faire, deux sdAbs par récepteur (E11 et H4 pour LRP8, C5 et B8 pour TfR, A9 et E6 pour SRB1) ont été fusionnés à un fragment Fc d’une IgG1 humaine et la capacité de ces 6 molécules à traverser une monocouche de cellules endothéliales cérébrales comme modèle de BHE in vitro a été évaluée. Nous avons montré que les sdAb-Fcs ciblant les récepteurs LRP8 et TfR, et dans une moindre mesure ceux ciblant SRB1, sont transportés à travers ce modèle, suggérant l’implication d’un processus de transcytose dépendant des récepteurs cibles. Au cours de la dernière étape du projet, nous avons évalué la capacité de distribution cérébrale des sdAbs, chez la souris in vivo. Nous avons montré que le H4-Fc, et plus faiblement le E11-Fc, s’accumulent significativement dans le parenchyme cérébral de manière LRP8-dépendante, jusqu’à 48h post-injection. Un adressage significatif du fragment Fc vectorisé avec le sdAb C5 ciblant le TfR a été mis en évidence dans le parenchyme à 2h post-injection, malgré une rétention dans les microvaisseaux cérébraux. Par contre, aucun adressage cérébral des sdAb-Fcs ciblant SRB1 n’a été observé, tandis que nous avons démontré une forte accumulation dans le foie et les glandes surrénales, deux organes connus pour exprimer SRB1 à des taux élevés. Ces résultats confirment le ciblage in vivo de ce récepteur par nos sdAbs, mais suggèrent une implication faible ou absente de SRB1 dans les processus de transcytose au niveau de la BHE. L’ensemble de nos résultats démontre l'intérêt du ciblage des récepteurs LRP8 et TfR et le potentiel des sdAbs en tant que vecteurs pour des applications de délivrance cérébrale, et confirme l'intérêt du ciblage de SRB1 via des sdAbs pour de l’adressage en périphérie.

Thesis resume

Diseases of the central nervous system (CNS) show an increasing prevalence rate, making the CNS therapeutic area one of the major pharmaceutical markets. However, the vast majority of the molecules developed to treat neurological diseases do not reach their targets efficiently enough because of the unique anatomical and physiological features of the blood-brain barrier (BBB). This barrier which plays a major protective role by controlling the flow of molecules, significantly limits the brain distribution of pharmacological agents. However, various transport systems exist to supply the CNS with essential nutrients, among which is receptor-mediated transcytosis (RMT). Hijacking this physiological system is considered a promising route for brain delivery of pharmacological agents with a strategy commonly compared to that of the "Trojan Horse". This strategy involves the conjugation of pharmacological agents to vector molecules developed to specifically target receptors present at the BBB and involved in RMT processes. During this project, we aimed to develop new vectors in the form of single-domain antibodies (sdAbs), specific for three receptors expressed at the BBB: LRP8, TfR and SRB1. In the first part of the project we immunized a llama with plasma membrane preparations from cells expressing the three receptors, in their human and mouse form, in order to promote the production of cross-specific antibodies. A phage library presenting sdAbs was then constructed and used to perform various phage display selection strategies. Following screening steps, the selected sdAbs (9 anti-LRP8, 4 anti-TfR, 11 anti-SRB1) were produced and characterized (affinities for the receptors, competitions with natural ligands). In a second part, we assessed the potential of the most promising sdAbs as vectors. Two sdAbs per receptor (E11 and H4 for LRP8, C5 and B8 for TfR, A9 and E6 for SRB1) were fused to a human IgG1 Fc fragment and the 6 fusion proteins were then tested for their ability to cross a monolayer of brain microvessel endothelial cells as an in vitro model of the BBB. We showed that the sdAb-Fcs targeting the LRP8 and TfR receptors, and to a lesser extent those targeting SRB1, are transported through this model, suggesting a receptor-dependent transcytosis process. During the last step of the project, we evaluated the brain distribution capacity of sdAbs, in mice in vivo. We showed that both H4-Fc, and E11-Fc accumulated in the brain parenchyma in a LRP8-dependent manner, up to 48 hrs post-injection. Regarding the TfR targeting, significant targeting of the Fc fragment vectorized with the C5 sdAb was demonstrated in the parenchyma 2 hrs post-injection, despite important retention in brain microvessels. Finally, at this stage, no cerebral targeting of sdAb-Fcs targeting SRB1 could be demonstrated, whereas a strong accumulation in the liver and the adrenal glands, two organs enriched in SRB1, was observed. These results confirm the in vivo targeting of this receptor by our sdAbs but suggest a weak or absent involvement of SRB1 in transcytosis processes at the level of the BBB. All these results demonstrate the potential of LRP8- and TfR-targeting sdAbs as vectors for brain drug delivery and also that of the SRB1-targeting sdAbs for the periphery delivery.