Soutenance de thèse de Miriam Diala EL AYOUBI

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Microbiologie
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Rhinovirus humains,hétérogénéité virale,génétique inverse,queue poly(A),sous-population virale,
Keywords
Human rhinovirus,viral heterogeneity,Reverse genetics,poly(A) tail,quasispecies,
Titre de thèse
Les rhinovirus humains: Développement de nouvelles méthodes de génétique inverse dédiées à l'amélioration de la conservation de l'hétérogénéité virale
Human rhinoviruses: Development of new reverse genetics methods dedicated to the improvement of the conservation of viral heterogeneity
Date
Lundi 17 Septembre 2018 à 13:30
Adresse
Faculté de Médecine-Timone, 27, boulevard Jean Moulin 13385 Marseille Cedex 05
salle 1
Jury
Directeur de these Xavier DE LAMBALLERIE UMR IRD 190, Emergence des pathologies virales (EPV), AMU, Faculté de Médecine-Timone, Marseille
Examinateur Christophe PEYREFITTE Institut de Recherche Biomédicale des Armées
Rapporteur Sylvie PILLET Laboratoire des agents infectieux et hygiène, CHU de Saint-Étienne
Rapporteur Alessandra FALCHI EA7310 Bioscope Corse-Méditerranée, Laboratoire de virologie

Résumé de la thèse

Les systèmes de génétique inverse permettent de manipuler les génomes viraux et se sont révélés essentiels pour étudier les virus à ARN.Récemment, une méthode basée sur la PCR, la méthode ISA (Infectious Subgenomic Amplicons), a été développée. Il s'agit d'une méthode génétique simple et polyvalente qui ne nécessite aucune étape de clonage et qui a été développée pour faciliter l'étude des virus à ARN positif simple brin. L'amplification par PCR peut générer des erreurs.Par conséquent, les méthodes de génétique inverse basées sur la PCR devraient être associées à une hétérogénéité virale artificielle.En conséquence, une autre nouvelle méthode de génétique inverse dérivée de l'ISA a été développée: 'SuPReMe' (Subgenomic Plasmids Recombination Method), dans laquelle des plasmides digérés contenant des fragments d'ADN subgénomique sont directement transfectés. La première partie de cette thèse se concentre sur la simplification de la méthode ISA. La principale contrainte de la méthode ISA est l'exigence de produire des fragments génomiques modifiés qui nécessite un promoteur de transcription à l’extrémité 5’ du premier fragment et un ribozyme du virus de l'hépatite delta, suivi du signal de polyadénylation du virus simien 40 (HDR / SV40pA) à l’extrémité 3’ du dernier fragment. Ici, nous proposons une nouvelle méthode simplifiée "Haiku", dans laquelle sont fournis les séquences du pCMV et de HDR / SV40pA en tant qu'amplicons séparés. Cette techinque améliorée a été appliquée avec succès à une large gamme de virus appartenant aux genres Flavivirus, Alphavirus et Entérovirus dans des cellules de moustiques et de mammifères. Nous démontrons également que, dans des conditions expérimentales spécifiques, la présence de HDR / SV40pA n'est pas nécessaire pour la génération du virus attendu. Les populations virales générées s à partir de systèmes de génétique inverse présentent différentes propriétés insuffisamment caractérisées, notamment en termes d'hétérogénéité génétique et de fitness réplicative.La deuxième partie de cette thèse est axée sur la caractérisation de la population virale issue de divers systèmes de génétique inverse. Ici, en utilisant le rhinovirus humain (HRV-B14) comme modèle, nous avons comparé la population virale et la fitness réplicative des virus générés en utilisant diverses méthodes de génétique inverse, y compris la transfection fréquemment utilisée des ARN produits par transcription in vitro T7, un clone infectieux dirigé par un promoteur CMV, la méthode ISA, la méthode Haiku, et la méthode SuPReMe. Nos résultats montrent que les clones infectieux dirigés par le promoteur du CMV et la méthode SuPReMe ont généré des populations virales presque clonales, tandis que les autres méthodes ont conduit à des populations virales avec une plus grande diversité génétique.De plus, la longueur de la queue poly(A) présente dans les extrémités 3’ des constructions génétiques inverses a été étudiée. Nos données révèlent que poly(A)25 est la longueur optimale pour récupérer HRV-B14 avec une grande efficacité et pourrait être utilisé pour générer des virus à ARN polyadénylés autres que HRV-B14. La troisième partie de cette thèse concerne la conservation de l'hétérogénéité virale. Les ARN polymérases virales présentent une faible fidélité, ce qui entraîne des taux de mutation relativement élevés au cours de la réplication de l'ARN viral. Par conséquent, les populations nouvellement générées de la plupart des virus à ARN sont extrêmement hétérogènes.Cette variabilité intra-population a été décrite comme un «spectre mutant».Notre but dans cette dernière partie est de détecter si la méthode "ISA" permet de conserver le spectre mutant présent dans l'échantillon viral original. L'utilisation possible d'enzymes de PCR qui présentent différents niveaux de fidélité pourrait être considérée comme un moyen de réguler la composition des variants dans le spectre mutant et vraisemblablement, en changeant le phénotype du virus généré

Thesis resume

Reverse genetics systems allow manipulating viral genomes and have proved to be essential for studying RNA viruses, in terms of producing genetically modified viruses, developing vaccine, and deciphering cellular and viral biological properties. Recently, a PCR-based method, the ISA (Infectious Subgenomic Amplicons) method, was developed. It is a simple, bacterium-fee reverse genetics method which is not requiring any cloning step and has been developed to facilitate the study of single-stranded positive-sense RNA viruses. PCR amplification can generate a low rate of undesired nucleotide changes, therefore, PCR-based reverse genetics methods are expected to be associated with artificial viral heterogeneity. Methods that generate (quasi-) clonal populations of viruses, such as infectious clone (IC) technology, are of specific interest. As a result, another new ISA-derived reverse genetics method designated as: ‘SuPReMe’ (Subgenomic Plasmids Recombination Method) was developed, in which digested plasmids containing subgenomic DNA fragments are directly transfected into permissive cells. The first part of this the present work focused on simplifying the ISA method. The main constraint of the canonic protocol of the ISA method is the requirement to produce modified genomic fragments encompassing the transcription promoter and the terminator. Here, we propose the ultimately simplified "Haiku" design in which transcription promoter and the terminator are provided as additional separate DNA amplicons. This improved procedure was successfully applied to the rescue of a wide range of viruses belonging to genera Flavivirus, Alphavirus and Enterovirus in mosquito and mammalian cells. We also demonstrated that, in specific experimental conditions, the presence of the terminator is not necessary to rescue the targeted virus. Viral populations recovered from reverse genetics systems display different properties that are insufficiently characterized, especially in terms of genetic heterogeneity and viral fitness. The second part of this work assessed the viral population issued from diverse reverse genetics systems. Using the human rhinovirus (HRV-B14, family: Picornaviridae, genus: Enterovirus, a small, nonenveloped, single-stranded positive-sense RNA virus) as a model, we compared the viral population and the replicative fitness of viruses generated using diverse reverse genetics methods, including the frequently used transfection of RNAs produced by in vitro T7 transcription, a CMV promoter-driven infectious clone, the rapid PCR-based ISA method, the ISA-derived Haiku method, and the enzymatic digestion-based SuPReMe method. Our results showed that CMV-promoter driven infectious clones and the SuPReMe method generated almost clonal viral populations, whilst other methods led to viral populations with higher genetic diversity. In addition, the length of the poly(A) tail present in the 3’ termini of the reverse genetics constructs was studied. Our data revealed that poly(A)25 is the optimal length to recover HRV-B14 with high efficiency and could be used to recover polyadenylated RNA viruses other than HRV-B14. The third part of the present work concerned the conservation of the viral heterogeneity. Viral RNA polymerases characteristically exhibit low fidelity which results in relatively high mutation rates during viral RNA replication. Consequently, newly generated populations of most RNA viruses are extremely heterogeneous. This intra-population variability has been described as a ‘‘mutant spectrum’’ or as “quasispecies”. Our aim in this last part was to detect whether the “ISA” method provides the opportunity to conserve the mutant spectrum present in the original viral sample. The possible use of PCR enzymes that exhibit different levels of fidelity could be considered as a means of regulating the variant composition within the mutant spectrum and presumably, changing the phenotype of the recovered virus.