Soutenance de thèse de Benjamin REMY

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Biochimie structurale
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Lactonase,Pansement,Antimicrobien,Antibiofilm,SsoPox,
Keywords
Lactonase,Bandage,Antimicrobial,Antibiofilm,SsoPox,
Titre de thèse
Développement d'une nouvelle génération de pansements antimicrobiens à base d'enzyme à activité lactonase
Development of a new generation of antimicrobial bandages using enzyme with lactonase activity.
Date
Mercredi 19 Septembre 2018 à 14:00
Adresse
Faculté de médecine, 27 boulevard Jean Moulin 13385 Marseille Cedex 5
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Jury
Directeur de these Eric CHABRIERE Aix Marseilel Université
CoDirecteur de these David DAUDé Gene&GreenTK
Examinateur Sophie BLEVES Aix Marseille Université
Rapporteur Alain FILLOUX Imperial College London
Rapporteur Antoine ANDREMONT Université Paris-Diderot

Résumé de la thèse

De nombreuses bactéries utilisent un système de communication, appelé quorum sensing (QS), qui leur permet de synchroniser leur comportement proportionnellement à la densité de population. Parmi elles, certaines bactéries pathogènes de l'homme, des animaux ou des plantes utilisent le QS pour coordonner leur virulence et la formation de biofilm à haute densité cellulaire. Bloquer la communication bactérienne, ou quorum quenching, constitue donc une piste prometteuse pour étendre l'arsenal thérapeutique antibactérien en vue de compléter voire remplacer l'action des antibiotiques qui sont associés à de nombreux phénomènes de résistance. L'antibiorésistance serait responsable de 700 000 morts par an ce qui en fait un enjeu majeur de santé publique. Durant cette thèse, un intérêt particulier a été porté à SsoPox, une lactonase hyperstable issue de l'archée extrémophile Sulfolobus solfataricus, capable d’hydrolyser les acyl homosérine lactones (AHL) impliquées dans le QS de certaines bactéries à Gram négative pathogènes de l'Homme comme Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia ou encore Pseudomonas aeruginosa. La grande stabilité de cette enzyme constitue un avantage technologique pour des applications dans le domaine de la santé comme le développement de dispositifs médicaux innovants pour lutter contre les infections associées au soin (IAS) pour lesquelles le taux de multirésistance peut dépasser les 20%. En vue de son incorporation dans des pansements, SsoPox a été étudiée et caractérisée pour son utilisation dans les infections à P. aeruginosa. La première partie de ce travail de thèse a consisté à étudier la résistance de l'enzyme aux contraintes industrielles rencontrées lors des procédés de fabrication des pansements. SsoPox s'est montrée tolérante à la chaleur (jusqu'à 150°C), aux solvants organiques, au stockage à température ambiante (plus de 300 jours) ou encore à la stérilisation (éthylène oxyde, autoclave, radiations). Dans une deuxième partie, l’efficacité de l’enzyme pour limiter la production de biofilm et de facteurs de virulence a été démontrée sur 2 souches modèles ainsi que 51 isolats cliniques de P. aeruginosa. SsoPox s'est par ailleurs révélée plus efficace que deux inhibiteurs chimiques connus du QS utilisés seuls ou combinés. De plus, l’efficacité de l’enzyme est conservée après immobilisation ce qui est particulièrement prometteur vis-à-vis de son utilisation dans des pansements. Enfin, une dernière partie a été consacrée à l'étude phénotypique et moléculaire du quorum quenching par voie enzymatique de P. aeruginosa. SsoPox et une autre lactonase GcL, isolée de Geobacillus caldoxylosilyticus et ayant un spectre d'action distinct sur les AHL, ont été comparées. Des expériences in vitro ont permis de mettre en évidence des impacts différents entre les deux enzymes sur les facteurs de virulence et la formation du biofilm. Une étude in vivo a montré que SsoPox, contrairement à GcL, réduit la virulence de P. aeruginosa à l'égard des amibes. L’étude de l’expression des gènes du QS et du protéome ont révélé des impacts distincts entre GcL et SsoPox, cette dernière se montrant globalement plus efficace pour bloquer des protéines intervenant dans le biofilm, la résistance aux antimicrobiens et la virulence. Ainsi SsoPox semble constituer un candidat de choix pour le développement de dispositifs médicaux innovants pour limiter les IAS.

Thesis resume

Numerous bacteria use a communication system, named quorum sensing (QS), to synchronize group behaviors according to population density. Among them, human, animal and plant pathogens use QS to coordinate virulence and biofilm formation at high cell density. Interfering with bacterial communication, or quorum quenching, represents a promising target to extent antibacterial drug resources to complement and even replace antibiotics which are associated with drug resistance. Antibiotic resistance would be responsible of 700 000 deaths a year, representing one of the major healthcare problems. Along this PhD project, the focus was brought to SsoPox, a hyperstable lactonase isolated from the thermophilic archaea Sulfolobus solfataricus, able to hydrolyze acyl homoserine lactones (AHL) involved in the QS of some human Gram-negative pathogen bacteria like Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia or Pseudomonas aeruginosa. The high stability of this enzyme is an important advantage for health applications like innovative medical devices to fight healthcare associated infections (HAI) for which the incidence of multidrug resistance can exceed 20%. In view of its incorporation into wound dressings SsoPox was studied and characterized for its use against P. aeruginosa infection. The first part of this project was to study the enzyme resistance to industrial constraints encountered during wound dressings manufacturing processes. SsoPox demonstrated a high tolerance to heat (up to 150°C), organic solvents, ambient temperature storage (more than 300 days) and to sterilization processes (ethylene oxide, autoclave, radiations). In a second part, the enzyme efficiency to limit biofilm and virulence factors production was shown on 2 model strains and 51 clinical isolates of P. aeruginosa. SsoPox was also more efficient than two well characterized chemical QS inhibitors, alone or combined. Furthermore, the enzyme kept its efficiency even when immobilized, which is especially promising for its use in wound dressings. Finally, a last part was dedicated to phenotypical and molecular study of enzymatic quorum quenching of P. aeruginosa. SsoPox and another lactonase GcL, isolated from Geobacillus caldoxylosilyticus, having distinct AHL specificities were compared. In vitro experiments highlighted different impacts between enzymes on virulence factors and biofilm production. An in vivo study showed that SsoPox, unlike GcL, was able to reduce P. aeruginosa virulence toward amoeba. QS gene expression and proteome study revealed distinct impacts between each enzyme treatment, SsoPox showing globally a higher efficiency to block biofilm, antimicrobial resistance and virulence proteins. Thus, SsoPox seems to be a prime candidate for development of innovative medical devices to limit HAI.