Soutenance de thèse de Mohammed TAHA

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Oncologie
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
cellules NK,leucémie myéloide aigue,Immunothérapie Adoptive,Pumilio2,proteine de liaison a l`ARN,
Keywords
NK cells,acute myeloid leukemia,Adoptive Immunotherapy,Pumilio2,RNA-Binding Protein,
Titre de thèse
l'utilisation de cellules natural killer (NK) comme outil thérapeutique: étude clinique de phase I de perfusion de cellules NK du donneur après HSCT. Annexe: Pumilio 2, une protéine de liaison à l'ARN surexprimée dans les cellules NK de patients atteints de LAM, réprime les fonctions des cellules N
the use of natural killer cells (NK) as a therapeutic tool: Phase I clinical study of NK donor lymphocyte infusion after HSCT. Annex: Pumilio 2, a RNA binding protein upregulated in NK cells from AML patients, represses functions of NK cells.
Date
Lundi 18 Juin 2018 à 14:00
Adresse
Institut Paoli-Calmettes 232 Boulevard de Sainte-Marguerite, 13009 Marseille
IPC2
Jury
Directeur de these Cyril FAURIAT Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, CRCM Inserm UMR1068, Aix Marseille Université U105, Institut Paoli Calmettes
Examinateur Christelle RETIERE INSERM UMR1232, CNRS ERL Institut de Recherche en Santé de l'Université de Nantes
Rapporteur Nicolas DULPHY Institut Universitaire d'Hématologie, Université Paris Diderot
Rapporteur Martin VILLALBA INSERM U1183, Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier (CHU)
Examinateur Régis COSTELLO AP-HM, Hôpital de La Conception, Service d'Hématologie et Thérapie Cellulaire, Marseille, France

Résumé de la thèse

Les cellules Natural Killer (NK) sont jouent un rôle essentiel dans la surveillance des hémopathies malignes. Cependant, les cellules tumorales développent des mécanismes immunosuppresseurs pour échapper à la reconnaissance et la lyse par les cellules NK. Ainsi, le maintien ou l'amélioration des performances des cellules NK sont considérés comme des défis majeurs. Dans ce travail, nous nous sommes concentrés sur les cellules NK dans le contexte de la leucémie myéloïde aiguë (AML) ainsi que la greffe de cellules souches hématopoïétiques post-allogéniques (allo-SCT). Au cours de mon doctorat, j'ai participé à 2 projets. Le premier projet concernait l’étude du rôle de pumilio 2, une protéine de liaison à l'ARN impliquée dans la répression de l'expression génique, dans les fonctions des cellules NK. J'ai fait face à plusieurs problèmes techniques lors de la réalisation de ce projet fondamental; par conséquent, les données restent préliminaires et sont exposées en annexe. Le deuxième projet concernait la surveillance des cellules NK après un essai clinique de phase I consistant en l'infusion de cellules NK allogéniques 2 mois après allo-SCT. Dans le premier projet, nous avons cherché à connaître le rôle de la protéine Pum2 dans la biologie des cellules NK en évaluant son expression et les conséquences de son invalidation. Nous avons observé surexpression du gène Pum2 dans les cellules NK de patients atteints de LAM ainsi que dans les cellules NK primaires de volontaires sains après stimulation. Après cela, nous avons utilisé la technique Lenti-CRICPR / Cas9 pour générer des cellules Pum2KO dans les lignées cellulaires NK92 pour explorer le rôle de Pum2 dans les cellules NK. Nos résultats ont montré une augmentation significative de l'expression de certains récepteurs activateurs (NKp30, NKp44, NKG2D et CD69) dans les cellules NK92-Pum2KO, tandis que l'expression du récepteur inhibiteur NKG2A était significativement diminuée par rapport aux cellules NK92WT. Nous avons également observé une amélioration de la fonction cytotoxique ainsi que de la sécrétion de cytokines (INF-γ et TNF-α) par les cellules NK92-Pum2KO en réponse à la stimulation des cellules cibles K562 et K562HLA-E. En outre, nous avons étudié l'effet de Pum2KO sur les voies d'activation de l'IL-2 et NKp30 dans les cellules NK. Nous avons trouvé plus de phosphorylation de Stat5 ainsi que Erk1/2 et Akt parmi les cellules NK92-Pum2KO en réponse à la stimulation par IL-2 et la stimulation par NKp30, respectivement. Dans le second projet, des doses croissantes de cellules NK activées par IL-2 ex-vivo ont été perfusées chez des patients atteints de tumeurs malignes hématologiques 2 mois après allo-SCT. Les objectifs de cette partie étaient d'évaluer l'impact de la perfusion de cellules NK activées sur la récupération et la biologie des cellules NK circulantes après l'allo-SCT et l'effet sur la reconstitution d'autres populations immunisées. Nos résultats ont montré une fréquence plus élevée des cellules NK dans la périphérie des patients traités. Bien que le phénotype immature soit remarquable peu après le traitement, les cellules NK circulantes, présentaient un état d'activation avec un profil de maturation amélioré après 6 mois de traitement. Nous avons également constaté que l'expression des récepteurs NK activateurs (NKG2D, NKp30 et NKp46) augmentait sur les cellules NK CD56dim circulantes des patients. De plus, ces cellules ont montré une augmentation significative de la capacité de dégranulation ainsi que de la sécrétion de cytokines (IFN-Ƴ et TNF-α) tout au long de l'étude. Ces différences ont notamment été observées chez les patients ayant reçu des doses plus importantes de cellules NK activées. En conclusion, nous supposons que la perfusion de fortes doses de cellules NK activées ex-vivo pourrait être associée à l'amélioration du phénotype et des fonctions des cellules NK au cours de la reconstitution immunitaire après allo-SCT.

Thesis resume

Natural killer (NK) cells are effector lymphocytes of the innate immune system that have the ability to kill transformed cells without prior stimulation. They play a critical role in hematological malignancies surveillance, however, tumor cells develop immunosuppressive mechanisms to escape NK cell-mediated killing. So, maintaining or improving NK cell performance is considered a major challenge. In this work we focused on NK cells in the context of acute myeloid leukemia (AML) as well as post allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-SCT). During my PhD study, I have been involved into 2 projects. The first project concerned the role of pumilio 2, a RNA binding protein involved in the repression of gene expression, in NK cell functions. I faced several technical issues while conducting this fundamental project; therefore the data remain preliminary and are exposed in the annex. The second project concerned the monitoring of NK cells after a phase I clinical trial consisting of infusing allogeneic NK cells 2 months after allo-SCT. In the first project, we sought to recognize the role of Pum2 protein in NK cell biology by assessing its expression and the consequences of its deletion. We observed an up-regulation of Pum2 gene in NK cells from AML patients as well as in primary NK cells from healthy volunteers after stimulation. After that we used Lenti-CRICPER/Cas9 technique to generate Pum2KO cells in NK92 cell lines to explore the role of Pum2 in NK cells. Our results showed a significant upregulation in the expression of some activating receptors (NKp30, NKp44, NKG2D and CD69) in NK92-Pum2KO cells, while the expression of NKG2A inhibitory receptor was significantly decreased compared with NK92WT cells. Concerning NK cell functions, we showed an enhancement of cytotoxic function as well as cytokine secretion (INF-γ and TNF-α) by NK92-Pum2KO cells in response to stimulation with K562 as well as K562HLA-E target cells. In addition, we studied the effect of Pum2KO on IL-2 and NKp30 activation pathways in NK cells. We found more phosphorylation of Stat5 as well as Erk1/2 and Akt among NK92-Pum2KO cells in response to IL-2 stimulation and NKp30 mAb stimulation, respectively. In the second project, three different doses (dose 1: 106 NK cell/Kg, n=3; dose 2: 5x106 NK cell/Kg, n=7; dose 3: >5x106 NK cell/Kg, n=6) of ex-vivo IL-2 activated NK cells were infused into patients with hematological malignancies after all-SCT. The goals of this part are to evaluate the impact of activated NK cells infusion on the recovery and biology of circulating NK cells post allo-SCT and the effect on the reconstitution of other immune populations. Our results showed higher frequency of NK cells in the periphery of patients treated with larger doses of activated NK cells. Although the notable immature phenotype shortly after treatment, the circulating NK cells in patients receiving larger doses of activated NK cells displayed more activation status with improved maturation profile after 6 months of treatment. We also found that the expression of activating NK receptors (NKG2D, NKp30, and NKp46) augmented on circulating CD56dim NK cells of patients receiving larger doses of activated NK cells. Moreover, these cells showed a significant increase in degranulation capacity as well as cytokine secretion (IFN-Ƴ and TNF-α) throughout study period. No significant changes in frequencies of other immune cells (CD3+, γδ T, CD8+, CD4+, CD4+Tregs, monocytes and DCs) were observed during study period.