Soutenance de thèse de Ruixing WANG

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie - Spécialité Immunologie
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
STED,Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence,microscopie de super-résolution,microscopie à fluorescence,
Keywords
STED,Fluorescence Correlation Spectroscopy,super-resolution microscopy,fluorescence microscopy,
Titre de thèse
STED-Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence pour des observations dynamiques en biologie cellulaire - De l'approche théorique à l'approche pratique
STED-Fluorescence Correlation Spectroscopy for dynamic observations in cell biology - From theoretical to practical approaches
Date
Mercredi 6 Juin 2018
Adresse
CIML, Parc Scientifique et Technologique de Luminy. Case 906. 13288, Marseille
amphitheatre du CIML
Jury
Directeur de these Didier MARGUET Centre d'Immunologie de Marseille Luminy, AMU UM2, CNRS UMR 7280, Inserm U1104
Rapporteur María GARCIA-PARAJO ICFO - The Institute of Photonic Sciences
Rapporteur Antoine DELON Laboratoire Interdisciplinaire de Physique
Examinateur Marc GUILLON Neurophotonics laboratory
Examinateur Philippe NAQUET Centre d'Immunologie de Marseille Luminy,AMU UM2, CNRS UMR 7280, Inserm U1104
CoDirecteur de these Hervé RIGNEAULT Institut Fresnel - UMR 7249

Résumé de la thèse

De grands progrès en microscopie super-résolution ont été réalisés au cours des dernières décennies pour dépasser la limite de diffraction optique. Cela a ouvert la voie à l'exploration des processus cellulaires à l'échelle nanométrique. Ces techniques de super-résolution offrent un nouvel aperçu de la description de l'organisation moléculaire dynamique de la membrane plasmique. Parmi ces techniques, la microscopie par déplétion d'émission stimulée (stimulated emission depletion, STED) dépasse la limite de diffraction optique et atteint une résolution de quelques dizaines de nanomètres. Plus important encore, le microscope STED est une technique polyvalente qui peut être combinée avec d'autres techniques telles que la spectroscopie par corrélation de fluorescence (fluorescence correlation spectroscopy, FCS), fournissant des résolutions spatiales et temporelles élevées pour explorer les processus dynamiques rapides qui se produisent dans les cellules vivantes. Ce projet de doctorat vise à mettre en œuvre un microscope STED, puis à combiner ce module STED avec la technique FCS pour les applications biologiques. Pour la mise en œuvre du module STED, un modulateur spatial de lumière a été utilisé pour façonner le foyer du faisceau STED, qui a été utilisé séquentiellement dans le module d'optique adaptative pour éliminer les aberrations optiques potentielles et, de plus, pour effectuer un alignement fin. Entre-temps, des études théoriques du STED et de la technique combinant STED et FCS ont permis de détailler certaines caractéristiques spatio-temporels. La distribution électromagnétique du faisceau STED et la fonction d'étalement ponctuel (point spread function, PSF) qui en résulte ont été calculées. L'analyse temporelle de l'efficacité d'épuisement STED dans différentes conditions a également été déterminée par le calcul d'équations de taux. Enfin, une solution analytique pour la fonction d'autocorrélation FCS a été dérivée dans l'état de déplétion STED incomplet. Étant donné qu'une telle déplétion incomplète peut biaiser les résultats des observations expérimentales, un nouveau modèle d'ajustement FCS a été proposé pour dépasser ce problème. Parmi les applications biologiques, la méthode de variation du volume d’observation FCS (spot variation FCS, svFCS) a démontré sa capacité à identifier la présence de nanodomaines limitant la diffusion latérale des molécules dans la membrane plasmique. L’approche STED-FCS permet d’étendre l’application de la svFCS à une échelle spatiale bien en dessous de la limite de diffraction optique afin d’évaluer la persistance plus ou moins importante de tels nanodomaines. Dans ce contexte, des simulations préliminaires de Monte Carlo ont été réalisées figurant des molécules diffusant en présence d'auto-assemblage/désassemblage dynamique des nanodomaines. Les résultats de simulation montrent que si les nanodomaines changent de taille rapidement et de manière extensive, les contraintes de diffusion latérale ne peuvent se distinguer d'un modèle de diffusion libre.

Thesis resume

Great progresses in super-resolution microscopy have been made over the past decades overcoming the optical diffraction limit. This has paved the path for the exploration of cellular processes at nanometer scale. Such super-resolution techniques offer new insight into the description of the dynamic molecular organization at the plasma membrane. Among these techniques, the stimulated emission depletion (STED) microscopy breaks the optical diffraction limit and reaches the resolution of tens of nanometer. More importantly, the STED microscope is a versatile setup that can be combined with other techniques such as fluorescence correlation spectroscopy (FCS), providing both high spatial and temporal resolutions to explore fast dynamic processes occurring in live cells. This PhD project aims at implementing a STED microscope, and then at combining this STED module with FCS technique for biological applications. For the implementation of the STED module, a spatial light modulator was used to shape the STED beam focus, which sequentially was used in the adaptive optics module to erase the potential optical aberrations and moreover to perform fine alignment. In the meantime, detailed theoretical studies on STED and the combined STED-FCS technique in spatio-temporal aspects were performed. The electromagnetic distribution of the STED beam and its resulting point spread function (PSF) were calculated. The temporal analysis of STED depletion efficiency with different conditions was also determined through the calculation of rate equations. Finally, an analytical solution for FCS autocorrelation function was derived in the condition of incomplete STED depletion. Since such incomplete depletion can bias the results of experimental observations, a new FCS fitting model was proposed to overcome this problem. Among the biological applications, the spot variation FCS (svFCS) method has demonstrated its capability to identify the presence of nanodomains constraining the lateral diffusion of molecules at the plasma membrane. The STED-FCS can extend the svFCS approach at a spatial scale far below the optical diffraction limit evaluating the long-lasting existence of such nanodomains. Within this frame, preliminary Monte Carlo simulations were conducted mimicking molecules diffusing in the presence of dynamic self-assembling/disassembling nanodomains. Simulation results show that if the nano-domains change their sizes rapidly and extensively, such diffusional constrain is undistinguishable from a free diffusion model.