Soutenance de thèse de Camille DION

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Pathologie Humaine - Spécialité Génétique humaine
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
épigénétique,hiPS,SMCHD1,D4Z4,FSHD,BAMS
Keywords
epigenetic,hiPS,SMCHD1,D4Z4,FSHD,BAMS
Titre de thèse
dynamiques épigénétiques du macrosatellite D4Z4 par la protéine smchd1 dans deux maladies rares : exploitation du modèle ips
D4Z4 epigenetic dynamics by the SMCHD1 protein in two unrelated diseases : lesson from ips
Date
Vendredi 18 Mai 2018 à 14:00
Adresse
27 boulevard Jean Moulin Faculté de Médecine la Timone 13385 Marseille
salle de thèse n°2
Jury
1251 Frédérique MAGDINIER Aix-Marseille Université - INSERM UMR
Rapporteur Julie DUMONCEAUX UCL (University College London)
Rapporteur Jérôme DEJARDIN Institut de génétique humaine de Montpellier (IGH)
Examinateur Jeanne AMIEL Institut Imagine - INSERM U1163

Résumé de la thèse

La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale (FSHD) est la troisième myopathie en terme de fréquence, caractérisée par un affaiblissement des muscles de la face, de la ceinture scapulaire et des bras progressant vers les membres inférieurs. Dans la majorité des cas (FSHD1), cette pathologie est liée à la contraction d'un élément macrosatellite répété en tandem au locus 4q35 : D4Z4. Dans les 5% des cas qui ne présentent pas de contraction de D4Z4 (FSHD2), des mutations dans le gène SMCHD1 sont retrouvées. Toutefois, les mécanismes moléculaires de cette pathologie restent mal compris, ce qui compromet le développement de thérapies ciblées. Mon projet de thèse porte sur les mécanismes moléculaires de la FSHD de type 2 et le rôle de SMCHD1 dans la régulation chromatinienne de l'élément D4Z4. Nous avons développé une méthode pour l'analyse de la méthylation du macrosatellite D4Z4 basée sur la modification de l'ADN au bisulfite de sodium couplée à du séquençage à haut débit. Nous avons montré une hypométhylation marquée chez les patients FSHD2 en particulier au niveau de la partie proximale de cet élément. Cette hypométhylation est moins marquée chez les patients FSHD1. Les données de la littérature suggèrent que l'hypométhylation est la conséquence secondaire de la réduction du nombre de D4Z4 ou de la perte de fonction de SMCHD1. L'étude de la méthylation au cours de la reprogrammation de fibroblastes primaires en cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) a permis de montrer que D4Z4 est reméthylé de façon spécifique lors de la reprogrammation dans les cellules FSHD1. Cette méthylation élevée est une caractéristique de la pluripotence puisqu'elle est observée également dans les cellules ES humaines et dépend probablement de SMCHD1 puisqu'elle n'est pas retrouvée dans les cellules de patients FSHD2. De plus grâce à un protocole de différenciation des cellules iPSCs en fibres du muscle squelettique, nous avons montré que D4Z4 se déméthylait au cours de la différenciation suggérant un mécanisme de régulation dynamique. L'hypométhylation de D4Z4 n'est pas observée lors de l'invalidation somatique du gène dans des cellules différenciées indiquant que SMCHD1 est impliqué dans la mise en place de la méthylation mais pas sa maintenance. Au cours de la reprogrammation, la reméthylation de D4Z4 est linéaire et précoce, et ne dépend pas de la mémoire épigénétique héritée des fibroblastes ni du nombre de répétitions D4Z4. Des mutations de SMCHD1 sont également associées à un syndrome développemental très rare, le syndrome de microphtalmie et d'arhinie de Bosma (BAMS). Les individus atteints présentent des anomalies cranio-faciales mais aucun signe musculaire. En revanche, nous avons montré une hypométhylation de D4Z4 confirmant le rôle de SMCHD1 dans la régulation épigénétique de cet élément. En accord avec cette hypothèse, nous montrons également une hypométhylation de D4Z4 chez des individus porteurs d'une délétion du locus 18p11.32 comprenant le gène. Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine confirment la liaison de SMCHD1 à la partie proximale de D4Z4. Cet enrichissement est diminué chez les patients et associé aux pertes des marques histone caractéristiques de l'hétérochromatine. Les analyses de RNA-seq dans ces deux pathologies ont permis de mettre en évidence une dérégulation de certains gènes associés à la région 4q35 ou de gènes soumis à l'empreinte parentale.

Thesis resume

Facio-Scapulo-Humeral Dystrophy is the third most common hereditary neuromuscular disease. The clinical phenotype is characterized by the progressive involvement of specific facial, scapulo-humeral and anterior foreleg muscles. In most cases (FSHD1) the disease is associated with a reduction in the number of copies of a 3.3kb tandemly repeated macrosatellite element, D4Z4, at the 4q35 locus. In the 5% remaining cases (FSHD2), the clinical phenotype appears without D4Z4 array contraction. A large proportion of these patients carry a mutation in the SMCHD1 gene. Despite the undeniable epigenetic etiology, the mechanisms underlying the disease remain unclear. My thesis project aimed at investigating the molecular mechanisms involved in FSHD2 and the chromatin regulation of the D4Z4 element by the SMCHD1 chromatin-associated factor. In order to study the D4Z4 methylation we developed an approach based on the highly resolutive Sodium Bisulfite sequencing method followed by high-throughput sequencing. We showed a significant hypomethylation in the proximal region of D4Z4 in FSHD patients compared to the controls, much more pronounced in the FSHD2 individuals. Data from the literature suggest that hypomethylation is the secondary consequence of D4Z4 array contraction or SMCHD1 loss of function. Our methylation analysis in primary fibroblasts and corresponding human induced pluripotent stem cells showed that D4Z4 is specifically remethylated upon reprogramming in FSHD1 cells but not in SMCHD1-mutated cells. Similarly, a high methylation level is observed in human embryonic stem cells carry a short (FSHD1) or long (Healthy donors) D4Z4 array, indicating that the high methylation level is a feature of pluripotency likely dependent on SMCHD1. Using a novel protocol for skeletal muscle differentiation we further showed that D4Z4 demethylation occurs upon differentiation. Strikingly, hypomethylation is not observed in somatic cells invalidated for SMCHD1 suggesting a key role for this factor in the methylation de novo but not for methylation maintenance. Altogether, our data indicate that D4Z4 methylation is a dynamic and specific process tightly regulated at the pluripotent stage. Upon reprogramming, D4Z4 remethylation is a linear process that occurs at early passages. In conclusion, D4Z4 methylation pattern does not depend on the epigenetic memory inherited form donor cells and the number of the D4Z4 copies but rather on the de novo acquisition of epigenetic marks at the pluripotent stage. A rare developmental syndrome called Bosma Arhinia Microphtalmia syndrome (BAMS) is also linked to mutations in SMCHD1. Affected individuals present cranio-facial abnormalities but no muscular dystrophy. We showed a D4Z4 hypomethylation in these patients highlighting the role of SMCHD1 in the epigenetic regulation of the D4Z4 element. In agreement with this observation, patients carrying a deletion encompassing the SMCHD1 gene locus (18p11.32), are also hypomethylated. Altogether these results confirm our hypothesis on the importance of SMCHD1 in D4Z4 methylation. Chromatin immunoprecipitation experiments ascertained the binding of the protein in the proximal region of the repeated element. The enrichment is decreased in patients and linked to the loss of heterochromatin histone marks. RNA-seq analysis in cells from controls, FSHD2 and BAMS allowed us to identify misregulation of some 4q35 genes and imprinted genes.