Soutenance de thèse de Giulia MANDALA'

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie - Spécialité Biologie Végétale
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
FHB,FCR,plantes transgéniques,HvUGT13248,détoxification du DON,pyramidage de gènes
Keywords
FHB,FCR,transgenic plants,HvUGT13248,DON detoxification,gene pyramiding
Titre de thèse
Renforcement et extension de la résistance du blé aux maladies causées par Fusarium par l’expression d’une UDP-glycosyltransférase d’orge capable de détoxifier le déoxynivalenol seule ou en conjonction avec l’expression d’inhibiteurs ectopiques de glycosidase.
Reinforcing and broadening wheat resistance against Fusarium diseases by a barley deoxynivalenol detoxifying UDP-glucosyltransferase and its pyramiding with ectopic glycosidase inhibitors
Date
Mardi 24 Avril 2018
Adresse
University of Tuscia, Department of Agricultural and Forestry Sciences (DAFNE). Via S. Camillo de Lellis s.n.c. 01100 Viterbo
Aula Perone Pacifico
Jury
Directeur de these Thierry GIARDINA Institut des Sciences Moléculaires de Marseille, Biosciences, UMR CNRS 7313, Aix-Marseille Université
CoDirecteur de these MARC MARESCA Institut des Sciences Moléculaires de Marseille, Biosciences, UMR CNRS 7313, Aix-Marseille Université
Directeur de these CARLA CEOLONI University of Tuscia, Department of Agricultural and Forestry Sciences (DAFNE)
Rapporteur Isabelle OSWALD INRA, UMR 1331 TOXALIM - E5 IMT: Immuno-Myco-Toxicology
Rapporteur Francesco FAVARON Università degli Studi di Padova, Dipartimento di Territorio e Sistemi Agro-Forestali (TeSAF)
Examinateur Daniela BELLINCAMPI Università degli Studi La Sapienza, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles Darwin, Edificio Botanica

Résumé de la thèse

Les maladies du blé causées par Fusarium, communément appelées fusarioses, notamment la fusariose de l’épi (FHB) et la pourriture de la tige (FCR), entrainent non seulement une réduction du rendement de production et de la qualité du blé mais également un problème de sécurité alimentaire lié à la présence dans les grains infectés de mycotoxines, dont le déoxynivalénol (DON). Le DON est un inhibiteur de la synthèse protéique qui agit comme un facteur de virulence durant la fusariose. La glycosylation du DON en D3G (DON-3-b-D-glucoside) catalysée par des UDP-glycosyltransférase (UGTs) est le principal mécanisme de protection des plantes vis-à-vis de la toxicité du DON. Améliorer la résistance du blé aux fusarioses que ce soit le blé panifiable ou le blé dur est de première importance, surtout pour le blé dur qui est particulièrement vulnérable aux fusarioses du fait d’un nombre limité de sources de résistance. Des études antérieures ont montrées que l’expression du gène d’orge HvUGT13248 confère une résistance du blé panifiable à la FHB (Li et al. 2015, MPMI 28:1237-46). Pour confirmer le rôle potentiel de l’expression de l’UGT dans la lutte contre la FHB, nous avons produit et infecté des plants de blé durs exprimant de manière constitutive ce gène (Ubi-UGT) ainsi que des plants de blé panifiable exprimant ce gène uniquement au niveau du tissu floral (Lem-UGT). Nos résultats montrent que l’expression du gène HvUGT13248 réduit significativement les symptômes de FHB (jusqu’à 30% de réduction) pour le blé dur durant les stades précoces de l’infection. Cette résistance est associée à une capacité accrue (x100) des plantes Ubi-UGT à convertir le DON en D3G associée à une réduction considérable du niveau de DON dans la semoule. Les blés panifiables Lem-UGT montrèrent aussi une diminution de la sévérité de la FHB avec une corrélation entre les niveaux d’expression de l’UGT et le niveau de protection observé. Ainsi, alors qu’une expression élevée du gène réduit de 40% les symptômes de la fusariose de l’épi à tous les stades de l’infection, seule une faible réduction est observée pour les plantes exprimant faiblement le gène. De manière surprenante, alors que la capacité de conversion des plantes Lem-UGT est multipliée par 10, le niveau de DON dans la farine n’est pas diminué, montrant l’importance du moment et du lieu d’expression de l’UGT dans la détoxification du DON et le contrôle de sa production. Nous avons également évalué l’effet de l’expression du transgène sur la FCR causée par F. culmorum. Nos résultats montrent que l’expression constitutive de l’UGT par le blé dur (Ubi-UGT) au stade de plantule réduit de près de 50 % les symptômes de la FCR. Ce résultat montre, pour la première fois, que l’expression transgénique d’UGT est associée à une résistance à la FCR. Finalement, afin d’évaluer si l’expression de plusieurs facteurs de résistance pouvait améliorer la résistance du blé aux fusarioses, nous avons généré des plants de blé exprimant à la fois l’UGT mais également des inhibiteurs des glycosidases qui sont impliquées dans la dégradation de la paroi cellulaire. Ont été généré des plants de blés durs UGT+PMEI et des plants de blés panifiables UGT+PGIP. Les plantes UGT+PMEI expriment de manière constitutive les gènes HvUGT13248 et AcPMEI (inhibiteur du kiwi de pectine méthyl estérase). Les plantes UGT+PGIP quant à elles expriment dans leur tissu floral le gène HvUGT13248 et de manière constitutive le gène PvPGIP2 (protéine de haricot inhibitrice de les polygalacturonases). Nos résultats montrent que l’expression du PMEI par les plantes UGT+PMEI n’a pas amélioré la résistance du blé à la FCR, les plantules doubles transgènes montrant les mêmes niveaux de symptômes que les plantules de blé n’exprimant que l’UGT. Par contre, les plantes UGT+PMEI et UGT+PGIP ont montrées une résistance accrue à la FHB, réduisant de manière plus importante les symptômes comparé aux souches simple transgène.

Thesis resume

Fusarium diseases, including Fusarium head b (FHB) and crown rot (FCR) represent major agricultural problems worldwide, causing reduction of grain yield and quality and food safety. The latter issue is associated with grain contamination by mycotoxins, particularly deoxynivalenol (DON), responsible for health problems in humans and animals. DON is a protein synthesis inhibitor acting as a virulence factor during pathogenesis. DON glycosylation, forming D3G by specific UDP-glucosyltransferases (UGTs), is the main mechanism involved in enhancing plant tolerance to DON. Improvement of FHB resistance is a major target in both bread and durum wheat, the latter being especially vulnerable as effective resistance sources are particularly limited. Previous studies demonstrated that the expression of the barley HvUGT13248 gene confers resistance to FHB in bread wheat (Li et al. 2015, MPMI 28:1237-46), reducing disease symptoms of almost 60% as compared to control plants. To highlight DON-detoxification potential in FHB control, we produced transgenic durum wheat plants constitutively expressing the HvUGT13248 gene (Ubi-UGT) and bread wheat plants expressing it in flower tissues (Lem-UGT). Transgenic plants were used in infection experiments with F. graminearum for evaluating FHB severity, as compared to wild-type plants. Our results showed that the HvUGT13248 gene determines in durum wheat Ubi-UGT plants a significant reduction of FHB symptoms (up to 30%) during early to mid stages of infection progress. Ubi-UGT plants showed much higher DON-to-D3G conversion ability (100x D3G/DON ratio) and a considerably reduced total DON content in semolina. The floral-specific expression in Lem-UGT bread wheat plants highlighted a dose-dependent efficacy of the UGT detoxification mechanism. Indeed, two transgenic lines with different levels of transcript expression showed that, while the higher expressing line determined a significant reduction of FHB symptoms (up to 40%) at all infection stages, only a slight reduction of FHB severity was observed in the lower expressing line, as compared to control plants. Although DON-to-D3G conversion increased (10x) in transgenic plants, total DON in flours resulted not different or even higher than the control. This possibly reflects the importance of timing and control of transgene expression in toxin detoxification and thus in restraining DON production. In addition, we verified for the first time the possible involvement of the DON-detoxifying approach in limiting FCR disease induced by F. culmorum. When challenged with the pathogen at the seedling stage, Ubi-UGT plants demonstrated significant reduction of almost 50% of FCR symptoms throughout the infection timing, as compared to control plants. This result represents the first report of FCR resistance improvement associated with overexpression of an UGT involved in DON-detoxification. Finally, in order to investigate if the combination of different mechanisms could further improve Fusarium disease resistance, we stacked transgenes controlling the DON-to-D3G conversion and the inhibition of cell wall degrading enzymes by glycosidase inhibitors in the same wheat genotype. To this aim, in the cross progeny of separate transgenic lines, durum wheat UGT+PMEI and bread wheat UGT+PGIP double-transgenic genotypes were selected. UGT+PMEI plants constitutively express HvUGT13248 and AcPMEI (kiwi pectin methyl esterase inhibitor) genes. UGT+PGIP plants express in floral tissues the HvUGT13248 gene and constitutively the PvPGIP2 (bean polygalacturonase inhibiting protein) gene. The PMEI contribution in UGT+PMEI plants resulted ineffective against FCR disease, the double-transgenic seedlings exhibiting similar level of symptom reduction to the UGT single transgenic line. On the other hand, both UGT+PMEI and UGT+PGIP plants exhibited increased resistance against FHB, further reducing FHB symptoms during infection, as compared to the separate transgenic lines.