Soutenance de thèse de Louis DUMAS

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie - Spécialité Biologie Végétale
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
photosynthèse,transfert d'électron,cytochrome b6f,mutagenèse aléatoire,Chlamydomonas reinhardtii,state transitions
Keywords
photosynthesis,electron transfer,cytochrome b6f,random mutagenesis,Chlamydomonas reinhardtii,state transitions
Titre de thèse
Rôles du cytochrome b6f dans la régulation des transitions d'état - Une étude structure-fonction
Regulatory roles of the cyt b6f complex in redox sensing and state transitions – A structure-function study
Date
Mercredi 24 Janvier 2018 à 9:00
Adresse
Bâtiment 120 CEA CADARACHE 13108 ST PAUL LEZ DURANCE
Amphithéâtre bât. 120
Jury
Directeur de these Gilles PELTIER Aix-Marseille Université
Rapporteur Francis-André WOLLMAN Institut de Biologie Physico-Chimique
Rapporteur Michel GOLDSCHMIDT-CLERMONT Université de Genève
Examinateur Wolfgang NITSCHKE Aix-Marseille University
CoDirecteur de these Jean ALRIC Aix-Marseille Université
Examinateur Alison SMITH University of Cambridge

Résumé de la thèse

La lumière du Soleil est une source d’énergie puissante mais fluctuante utilisée par les organismes photosynthétiques pour alimenter l’assimilation du CO2 atmosphérique en espèces carbonées réduites. Pour optimiser l’efficacité photosynthétique en conditions de lumière changeantes, les organismes de la lignée verte régulent la distribution de l’excitation lumineuse entre les deux photosystèmes grâce aux transitions d’état. Ce processus est modulé par l’état redox du réservoir membranaire de quinones, des transporteurs d’électrons liposolubles. Par un mécanisme encore inconnu, le cytochrome (cyt) b¬6f détecte ces changements redox et transmet un signal d’activation à la kinase des transitions d’état, Stt7. Afin de comprendre le rôle du cyt b¬6f, nous avons mis au point une nouvelle stratégie expérimentale combinant la mutagénèse aléatoire d’un gène chloroplastique (petD codant pour la sous-unité IV du cyt b¬6f) par PCR error-prone, la transformation chloroplastique et la sélection des clones sur leur croissance phototrophe. L’analyse des séquences variantes permettant l’assemblage et le fonctionnement du cyt b¬6f a révélée certaines caractéristiques intéressantes de la robustesse de cette sous-unité aux mutations dans le contexte du complexe protéique transmembranaire auquel elle appartient. Les transformants ont ensuite été criblés par imagerie de l’émission de fluorescence de la chlorophylle sur leur capacité à réaliser des transitions d’état. Plusieurs mutants de transitions d’état ont été ainsi isolés, et le séquençage a révélé que les mutations impliquées étaient concentrées sur la boucle stromale fg de la sous-unité IV. La mutagénèse dirigée de plusieurs résidus clés de la boucle fg a montré que les substitutions des résidus Asn122, Tyr124 et Arg215 généraient des mutants bloqués à l’état I indépendamment de l’état redox du pool de quinones et sans effets défavorables sur l’assemblage et l’activité de transfert d’électrons du complexe. Des expériences d’interaction protéine-protéine ont ensuite servi à prouver que le domaine kinase de Stt7 interagit avec la boucle fg de la sous-unité IV et que son activité d’autophosphorylation dépend du résidu Arg125. Nous proposons un modèle de l’interaction entre ces deux protéines ainsi que du mécanisme d’activation de la kinase médié par le cyt b6f.

Thesis resume

Sunlight is a powerful but fluctuating energy source used by photosynthetic organisms to power the assimilation of atmospheric CO2 into reduced carbon compounds. To optimize photosynthetic efficiency in ever-changing light conditions, organisms of the green lineage regulate the distribution of energy input between the two photosystems through state transitions. This process is governed by the redox state of the membrane pool of quinones, liposoluble electron carriers. Through a yet unknown mechanism, the cytochrome (cyt) b¬6f complex detects these redox changes and transmits a signal to the state transition kinase Stt7 for its activation. In order to decipher the role of the cyt b¬6f, we devised a novel experimental strategy combining the random mutagenesis of a chloroplast gene (petD coding for cyt b¬6f subunit IV) by error-prone PCR, chloroplast transformation and selection of clones on phototrophic growth. Analysis of variant sequences allowing proper assembly and function of cyt b¬6f revealed some interesting features on the mutational robustness of this subunit in the context of its large transmembrane protein complex. Transformants were then screened by chlorophyll fluorescence emission imaging on their ability to perform state transitions. Several state transition mutants were isolated, and sequencing revealed that mutations concentrated in the stromal fg loop of subunit IV. Site-directed mutagenesis of key fg loop residues showed that substitutions of Asn122, Tyr124 and Arg125 produced mutants that are blocked in State I independently of the redox state of the PQ pool and with no adverse effects on cyt b6f assembly and electron transfer activity. Protein-protein interaction studies provided evidence that the kinase domain of Stt7 interacts with the subunit IV fg loop and that its autophosphorylation activity depends on Arg125. We propose a model for the interaction between these two proteins as well as for the cyt b6f-mediated mechanism of Stt7 activation.