Soutenance de thèse de Manon TORRES

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Neurosciences
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
long ARN non codant,rythmes,hypophyse,Circadien,
Keywords
long non coding RNA,rhythms,pituitary,Circadian,
Titre de thèse
Rôle du long ARN non codant Neat1 dans la rythmicité circadienne hypophysaire
Significance of the long non coding RNA Neat1 in the pituitary rhythmicity
Date
Vendredi 19 Janvier 2018 à 14:30
Adresse
Salle des thèses Faculté de médecine secteur Nord Marseille Boulevard Pierre Dramard, 13344 Marseille
Salle des thèses faculté de médecine nord
Jury
Directeur de these Anne-Marie FRANCOIS-BELLAN CRN2M-UMR6231
Rapporteur Valérie SIMONNEAUX Institut des Neurosciences Cellulaires et Intégratives
Rapporteur Frédéric GACHON École polytechnique fédérale de Lausanne
Examinateur Michel KHRESTCHATISKY UMR 7259, N.I.C.N.

Résumé de la thèse

Du fait de la rotation de la terre sur son axe, les organismes vivants sont confrontés à un changement quotidien de leur environnement correspondant à l’alternance des jours et des nuits. Parce qu’il y a un avantage sélectif à anticiper ces variations journalières, la majorité des espèces ont développé des horloges endogènes leur permettant cette anticipation. Chez les mammifères, cette horloge endogène contrôle la rythmicité de nombreuses fonctions qui vont osciller avec une période proche de 24h, dite circadienne. La rythmicité d’un grand nombre de ces fonctions repose sur une expression rythmique de gènes et dans chaque tissu, le transcriptome circadien est estimé entre 8 à 40% des gènes exprimés. Le mécanisme moléculaire à la base du fonctionnement des oscillateurs circadiens implique des boucles de rétro-contrôle de la transcription, et ce mécanisme transcriptionnel permet de contrôler la rythmicité d’expression de nombreux gènes cibles. Cependant plusieurs études récentes montrent que 80% des gènes rythmiques sont contrôlés par des mécanismes post-transcriptionnels. Au cours de notre étude nous avons identifié un mécanisme post-transcriptionnel impliqué dans le contrôle de l’expression rythmique de gènes. Ce mécanisme implique des corps nucléaires appelés paraspeckles, présents dans les cellules de mammifères. Les paraspeckles sont organisés autour d’un long ARN non codant (lncRNA), Neat1, auquel s’associent plusieurs protéines de liaison aux ARNs. Fonctionnellement ces paraspeckles peuvent retenir dans le noyau des ARNs, particulièrement les ARNm possédant dans leur région 3’ non codante (3’UTR) des motifs de type IRAlu. Nous avons montré dans une lignée de cellules hypophysaires somato-lactotropes (GH4C1) que les composants principaux des paraspeckles, dont Neat1, sont exprimés de manière circadienne, ce qui induit une variation circadienne du nombre de paraspeckles dans le noyau des cellules. En introduisant une séquence de type IRAlu dans la région 3’UTR du gène rapporteur Egfp et en faisant exprimer de manière stable cette construction par des cellules GH4C1, nous avons montré un rythme circadien de la rétention nucléaire de l’ARNm Egfp associé à un rythme circadien de l’expression de la protéine EGFP détectée par vidéo-microscopie en temps réel. Lorsque les paraspeckles sont détruits après transfection des cellules par des siRNA ou des ologonucléotides antisens dirigés contre Neat1, ces rythmes disparaissent. Pour connaître l’ensemble des ARNm endogènes qui peuvent être retenus par les paraspeckles, nous avons développé une technique de « RNA pull-down » qui permet d’isoler les partenaires moléculaires d'un long ARN non codant. En couplant cette approche à du séquençage haut débit des ARNs, nous avons établi la liste des ARNs associés à Neat1 et donc retenus par les paraspeckles. L’analyse des régions 3’UTR de ces ARNs n’a pas permis d’identifier des motifs IRSINE, analogues chez le rat des motifs IRAlus des primates. Dans le but d’identifier d’autres déterminants moléculaires présents dans les ARNm capables de s’associer aux paraspeckles, nous avons sélectionné trois ARNm cibles de Neat1, et nous avons inséré leurs régions 3’-UTR, intégrales ou bien fragmentées, en aval de la partie codante du gène rapporteur Egfp. Cette étude nous a permis de conclure que la reconnaissance par les paraspeckles peut impliquer des régions autres que la région 3’UTR des ARNs, et que dans la région 3’UTR, plusieurs motifs agissant de concert participent à la liaison aux paraspeckles. L’ensemble des travaux réalisés nous a donc permis d’identifier un nouveau mécanisme post-transcriptionnel permettant l’expression circadienne de gènes dans les cellules hypophysaires, mais aussi potentiellement dans d’autres structures de l’organisme et d’autre part d’attribuer un rôle physiologique dans le fonctionnement du système circadien à un long ARN non-codant et à des sous domaines nucléaires dont les fonctions demeurent énigmatiques.

Thesis resume

As a result of earth rotation on its axis, living organisms are confronted to daily changes of their environment that follow the day and night cycle. To be able to anticipate those changes by developing an internal clock represents an evolutionarily conserved adaptation that can be tracked back to the earliest life forms. In mammals, this endogenous clock controls several functions, which then oscillate with a period close to 24h, which is called circadian. The circadian rhythmicity of cellular, physiological and behavioral functions is driven by a rhythmicity of gene expression. Circadian transcriptome is evaluated to 8 to 40% of expressed genes in each tissue. The molecular mechanism supporting circadian oscillators involves transcriptional-translational feedback loops; it allows controlling the rhythmic expression of many clock-controlled genes. However, recent studies show that 80% of rhythmic genes are controlled by post-transcriptional mechanisms. Throughout our study, we identified a post-transcriptional mechanism involved in gene circadian expression control. This mechanism involves nuclear bodies called paraspeckles that are expressed in mammalian cells. Paraspeckles are organized around a long noncoding RNA (lncRNA), Neat1, to whom several RNA-binding proteins are associated. Paraspeckles are known to retain in the nucleus RNAs containing in their 3’-UTR inverted repeats of Alu sequences (IRAlu) allowing by this way to repress RNAs cytoplasmic export. In a pituitary somatolactotroph cell line (GH4C1) we showed that all components of paraspeckles including four major proteins and Neat1 itself displayed a circadian expression pattern, which induces a circadian variation of paraspeckle number in cells. By inserting an IRAlu element in the 3’UTR of Egfp and stably transfecting this construction in GH4C1, we showed a circadian nuclear retention of the Egfp-mRNA correlated with the EGFP protein circadian expression, detected by real-time videomicroscopy. When paraspeckles are disrupted with siRNA or antisens oligonucleotides against Neat1, those rhythms disappear. In order to identify all the endogenous mRNAs retained by paraspeckles, we developed a method called “RNA pull-down” that allows extracting all molecular partners of a lncRNA. This approach followed by high throughput RNA sequencing allowed us to establish the list of Neat1 RNA targets that can be potentially retained in paraspeckles. By analyzing 3’UTR regions of those mRNA, we didn’t find IRSINE elements, analogous in rats to IRAlu in humans. To identify other structural elements present in paraspeckle associated RNAs, we selected three Neat1 target mRNAs. Their 3’UTR were inserted, fully or partially, downstream the Egfp coding sequence. Those experiments allowed us to conclude that recognition by paraspeckles can involve regions other than the 3’UTR, and within the 3’UTR several elements can participate together in the association to paraspeckles. To conclude, this study allowed us to identify a new post-transcriptional mechanism that can induce gene circadian expression in pituitary cells, but also potentially in other tissues. On another hand, it enabled us to assign a new physiological function in circadian system to a lncRNA and to nuclear bodies whose functions are mainly unknown.