Soutenance de thèse de Estelle CARMINITA

La thrombose est l'une des causes principales de mortalité dans le monde. La formation d’un thrombus et en particulier d’un thrombus plaquettaire reste cependant mal compris. Notre équipe de recherche a été un des premières à montrer que les neutrophiles jouaient un rôle important dans la formation d’un thrombus en exprimant du facteur tissulaire (FT). Récemment, cependant, différentes études ont suggéré un rôle pro-coagulant non pas directement des neutrophiles mais des NETs, des fibres d’ADN et de protéines sécrétées par les neutrophiles. L'objectif de ce travail de thèse a été, en utilisant des modèles murins et des technologies d’imagerie innovantes, de déterminer le rôle des neutrophiles et des NETs dans la formation d'un thrombus plaquettaire. Pour ce faire, nous avons travaillé sur deux modèles de thrombose : la blessure au rayon laser sur une artère et la restriction partielle du flux sanguin sur une veine (modèle DVT). Nos résultats indiquent qu'à la suite d'une blessure au laser, les plaquettes s'accumulent au site de blessure, s'agrègent et s'activent. Cependant, cette activation plaquettaire n’est pas homogène. L'étude morphologique d’un thrombus, par microscopie électronique en 3 dimensions (3D), a révélé l'existence d'un double gradient d'activation des plaquettes transversal et longitudinal. Nous avons également pu démontrer que, dans ce modèle de thrombose, les plaquettes, à la différence de l’endothélium et des neutrophiles, n'expriment pas de phospholipides négatifs à leurs surfaces. Les plaquettes sanguines ne sont donc pas nécessaires à l'activation de la cascade de coagulation. Ces résultats indiquent cependant que les neutrophiles pourraient jouer un rôle majeur dans l’activation de la cascade de coagulation pas seulement en exprimant du FT à leur surface mais également en exprimant des phospholipides négatifs. Afin de déterminer le rôle des NETs dans ce modèle de blessure au laser, nous avons ensuite utilisé de la DNAse-I. Ce traitement inhibe significativement la formation du thrombus. Cependant, après étude des thrombi en microscopie électronique 3D, aucun NETs n'a pas été détecté. Afin de comprendre cette apparente contradiction nous avons voulu étudier la spécificité de la DNAse-I. La DNAse-I est capable de dégrader l'ATP et l'ADP et ainsi de générer de l'adénosine, un antagoniste des neutrophiles. L’ajout de DNAse-I inhibe l’agrégation des plaquettes induite par l’ADP et l’activation des neutrophiles à l’ATP. Enfin, nous avons pu montrer que les marqueurs classiquement étudiés pour caractériser la présence de NETs (H3Cit, PAD4 et NE) étaient également exprimés après « simple » activation des neutrophiles. Nous avons finalement voulu comparer ces résultats dans un autre modèle de thrombose, le modèle de DVT. Les coupes immunohistochimiques de ces thrombi révèlent des successions de leucocytes s’agrégeant en "chaînettes" dans la région distale. Ces enchainements sont composés d'éléments cellulaires Ly6G+ et H3Cit+. Des expériences de microscopie électronique 3D ont révélé que ces "chainettes" de leucocytes longues de plusieurs micromètres sont composées de cellules avec des membranes plasmiques et nucléaires intactes, aucun filament d'ADN correspondant à des NETs n'est observable. Ainsi, nous pouvons conclure que dans ce second modèle de thromboses, les NETs ne semblent pas être impliqués dans la formation du thrombus. L’ensemble des résultats obtenus apportent de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans la formation d’un thrombus et l'activation de la cascade de coagulation. Elles identifient les neutrophiles - mais pas les NETs - comme des acteurs importants de la thrombose dans des modèles murins.

Thrombosis is one of the main causes of death in the world. However, the formation of thrombus and in particular platelet thrombus remains poorly understood. Our research team was one of the first to show that neutrophils play an important role in thrombus formation by expressing tissue factor (TF). Recently, however, different studies have suggested a pro-coagulant role not directly by neutrophils but NETs, DNA fibers and proteins secreted by neutrophils. The objective of this thesis was, using mouse models and innovative imaging technologies, to determine the role of neutrophils and NETs in platelet thrombus formation. To do so, we worked on two models of thrombosis: laser induced injury on an artery and partial blood flow restriction on a vein (DVT model). Our results indicate that following a laser injury, platelets accumulate at the injury site, aggregate and become activated. However, this platelet activation is not homogeneous. The morphological study of a thrombus, by 3D electron microscopy, revealed the existence of a double gradient of platelet activation, transversal and longitudinal. We were also able to demonstrate that, in this model of thrombosis, platelets, unlike the endothelium and neutrophils, do not express negative phospholipids on their surfaces. Thus, blood platelets are not required for activation of the coagulation cascade. However, these results indicate that neutrophils may play a major role in the activation of the coagulation cascade not only by expressing TF on their surface but also by expressing negative phospholipids. To determine the role of NETs in this model of laser injury, we then used DNAse-I. This treatment significantly inhibited thrombus formation. However, after studying the thrombi by 3D electron microscopy, no NETs were detected. In order to understand this apparent discrepancy, we wanted to study the specificity of DNAse-I. DNAse-I is able to degrade ATP and ADP and thus generate adenosine, a neutrophil antagonist. The addition of DNAse-I inhibits ADP-induced platelet aggregation and neutrophil activation to ATP. Finally, we were able to show that the markers classically studied to characterize the presence of NETs (H3Cit, PAD4 and NE) were also expressed after a "simple" neutrophil activation. We finally wanted to compare these results in another model of thrombosis, the DVT model. Immunohistochemical sections of these thrombi reveal successions of leukocytes aggregating in "chains" in the distal region. These chains are composed of Ly6G+ and H3Cit+ cellular elements. 3D electron microscopy experiments revealed that these micrometers long "chains" of leukocytes are composed of cells with intact plasmic and nuclear membranes, no DNA filaments corresponding to NETs are observable. Thus, we can conclude that in this second model of thrombosis, NETs do not seem to be involved in thrombus formation. The results obtained provide new knowledge on the mechanisms involved in thrombus formation and activation of the coagulation cascade. They identify neutrophils - but not NETs - as important actors of thrombosis in mouse models.