Soutenance de thèse de Wanassa BEROUAL

Les ARN non-codants régulant le cycle cellulaire chez Caulobacter crescentus Les bactéries sont des modèles puissants pour comprendre comment les cellules se divisent et exécutent des programmes de régulation globale. En utilisant Caulobacter crescentus (C. crescentus) comme organisme modèle, j'ai étudié de nouveaux aspects de son cycle cellulaire unique. Chez cette bactérie, une cascade de régulateurs régit la progression du cycle cellulaire. Parmi eux, le régulateur principal CtrA est essentiel pour contrôler la réplication de l'ADN et l'expression de plus de 100 gènes impliqués dans des processus fondamentaux, tels que la méthylation de l'ADN, la division cellulaire et la morphogenèse des structures polaires. Tout au long du cycle cellulaire, après la dégradation complète de CtrA au début de la réplication de l'ADN, au moins deux vagues d'expression de CtrA se produisent. La première dépend de GcrA qui déclenche l'activation du promoteur ctrA-P1 conduisant à une première faible accumulation de CtrA. Par la suite, le premier pool de CtrA se lie à son propre second promoteur ctrA-P2, conduisant à une plus forte accumulation. Cette deuxième vague d'expression peut être opérée par des mécanismes post-transcriptionnels inconnus. En dépit de décennies de recherche, aucun contrôle par des ARN non-codants (ARNnc) n'a été associé aux régulateurs principaux du cycle cellulaire de C. crescentus. Les ARNnc sont apparus comme des régulateurs globaux de centaines de gènes, qui existeraient chez toutes les bactéries et qui réguleraient de multiples processus, tels que la réponse adaptative au stress. Néanmoins, leur caractérisation, principalement réalisée chez quelques organismes modèles, reste un défi chez d'autres espèces. La majorité des exemples liés à la régulation médiée par les ARNnc sont centrés sur la description de leur capacité à contrôler des voies activées conditionnellement, souvent liées au stress. Peu de travaux ont été entrepris pour déterminer si les ARNnc sont des candidats potentiels pour la régulation de processus fondamentaux qui sont en fait dépendants du cycle cellulaire. Dans une étude précédente, j'ai montré que les ARNnc détectés chez C. crescentus sont en effet potentiellement liés à des voies clés du cycle cellulaire, créant ainsi un réseau interconnecté entre les régulateurs transcriptionnels et les ARNnc. Profitant du remarquable cycle cellulaire de C. crescentus, j'ai concentré mes travaux sur l'étude de CcnA (Cell Cycle Non-coding RNA A) putativement activé par CtrA. CcnA est un ARNnc particulier car son gène est situé à l'origine de la réplication. J'ai utilisé la technique “MS2 affinity purification and high-throughput RNA sequencing” (MAPS) dans le but de capturer le targetome in vivo de CcnA. Une combinaison d'expériences in vivo, in vitro et de mutagenèse a suggéré que la CcnA régule positivement la traduction de la CtrA en se liant directement à la région 5' non traduite (5'UTR) de l'ARN messager (ARNm) de ctrA-P2. De plus, CcnA se lie également à la région 5'UTR de l’ARNm d'un autre régulateur principal de la phase S de C. crescentus : GcrA. J'ai montré que CcnA joue un rôle clé dans la physiologie de l'origine de réplication de C. crescentus et que sa transcription est cruciale pour la progression correcte du cycle cellulaire. De plus, le rôle de CcnA semble être conservé chez d'autres espèces d'alpha-protéobactéries telles que Sinorhizobium meliloti, soulignant que CcnA est un potentiel élément clé régulant le cycle cellulaire chez les alpha-protéobactéries.

Non-coding RNAs regulating the cell cycle in Caulobacter crescentus Bacterial cells are powerful models for understanding how cells divide and perform global regulatory programs. By using Caulobacter crescentus (C. crescentus) as a model organism, I’ve been investigating novel aspects of its unique cell cycle. In this bacterium, a cascade of regulators governs cell cycle progression. Among them, the master regulator CtrA is pivotal for controlling DNA replication and the expression of more than 100 genes involved in fundamental processes, such as DNA methylation, cell division and polar structure morphogenesis. Throughout the cell cycle, after CtrA is completely degraded at the onset of DNA replication, at least two waves of CtrA expression occur. The first depends on GcrA to trigger activation of ctrA-P1 promoter leading to a first low accumulation of CtrA. Subsequently, first pool of CtrA binds to its own second promoter ctrA-P2, leading to a stronger accumulation. Such a second wave of expression may be operated by unknown post-transcriptional mechanisms. Despite decades of investigation, no control by non-coding RNAs (ncRNAs) has been associated with the master regulators of C. crescentus cell cycle. NcRNAs have emerged as global regulators of hundreds of genes, putatively existing in all bacteria and regulating multiple processes, such as the adaptive response to stress. Nonetheless, their characterization, mainly performed in a few model organisms, remains a challenge in other species. The majority of examples related to ncRNA-mediated regulation are centered on the description of their ability to control conditionally activated, often stress-related, pathways. Few studies have been undertaken to determine whether ncRNAs are potential candidates for regulation of fundamental processes that are actually cell cycle dependent. In a previous study, I showed that C. crescentus predicted ncRNAs are indeed potentially linked to key cell cycle pathways, creating an interconnected network between transcriptional regulators and ncRNAs. Benefiting from the remarkable cell cycle of C. crescentus, I focused my work on the study of the "Cell Cycle Non-coding RNA A" (CcnA) putatively activated by CtrA. CcnA is a peculiar ncRNA because its gene is located at the origin of replication. I used MS2 affinity purification and high-throughput RNA sequencing (MAPS) with the aim of capturing the in vivo targetome of CcnA. A combination of in vivo, in vitro, and mutagenesis experiments suggested that CcnA positively regulates CtrA translation by directly binding to the 5' untranslated region (5'UTR) of ctrA-P2 mRNA. In addition to this, CcnA also binds to the 5'UTR of yet another master regulator of C. crescentus S-phase; GcrA. I have shown that CcnA plays a key role in the physiology of the origin of replication of C. crescentus and that its transcription is crucial for proper cell cycle progression. Furthermore, the role of CcnA appears to be conserved in other alpha-proteobacterial species such as Sinorhizobium meliloti, highlighting CcnA as a potential key element regulating the cell cycle in Alphaproteobacteria.