Soutenance de thèse de Camille MAILHAC

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie - Spécialité Immunologie
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Anticorps,RCPG,Nanobodies,,
Keywords
Antibody,RCPG,Nanobodies,,
Titre de thèse
Développement de senseurs conformationnels ciblant les protéines G pour l'étude de la signalisation médiée par les récepteurs couplés aux protéines G, basés sur l'utilisation d'anticorps à domaine unique de lama.
Development of llama single domain antibody-based conformational sensors targeting G proteins for the study of G protein coupled receptors-mediated signaling
Date
Mercredi 18 Octobre 2017 à 14:00
Adresse
Faculté des sciences de la Timone 27 Boulevard Jean Moulin, 13005 Marseille
Amphi 2
Jury
Directeur de these Patrick CHAMES INSERM
Examinateur Philippe NAQUET Université Aix Marseille
Examinateur Elodie DUPUIS Entreprise Cisbio
Examinateur Philippe RONDARD CNRS
Rapporteur Jacqueline CHERFIL CNRS
Rapporteur Gisèle CLOFENT-SANCHEZ Université de bordeaux Victor Segalen

Résumé de la thèse

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) constituent l'une des plus grandes familles de récepteurs de surfaces cellulaires. Ils constituent une cible de choix autant pour des études fondamentales de biologie moléculaire, que dans des domaines plus appliqués de recherche médicale et pharmaceutique. Dans certains contextes, il peut être souhaitable d'activer sélectivement une voie unique. Par conséquent, des efforts considérables sont déployés pour découvrir des ligands dits biaisés capables d’activer sélectivement certaines des protéines G. Pour tester de telles activités, il est essentiel de mesurer avec précision la capacité des composés à activer ces voies, dans des conditions proches du contexte physiologique. Un grand nombre de tests sont disponibles pour étudier les GPCR. Ils comprennent la mesure de l'activité effectrice ou des seconds messagers, tels que IP1, Ca2+, AMPc. Ces stratégies sont limitées car elles mesurent des événements distaux qui pourraient être soumis à une compartimentation, une amplification. De plus, certaines de ces voies de signalisation peuvent être activées par plusieurs protéines G. D'autres dosages sont basés sur des mesures de liaison du ligand, en utilisant des composés radioactifs ou fluorescents. Ces essais permettent la caractérisation du site de liaison ou l'activation de la protéine G en utilisant des analogues du GTP. Ils peuvent être utilisés avec des cellules natives, mais ils sont limités en termes d'analyse à haut débit. Une possibilité est d'utiliser des fusions des protéines G à des gènes rapporteurs pour des analyses basées sur le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence. Ces approches ne peuvent cependant pas être utilisées sur des cellules ou des membranes natives. Dans cette étude nous avons mis en place une approche pour l’étude de l’activation des GPCR. Au cours des dernières décennies, les nanobodies se sont révélés être des outils très utiles pour l'étude des systèmes biologiques dynamiques. Les Nanobodies, également appelés VHH ou anticorps à domaine unique, correspondent au domaine variable d’une classe d'anticorps dépourvus de chaîne légère, produits naturellement par les camélidés. Contrairement aux anticorps monoclonaux classiques beaucoup plus gros (150 kDa), les nanobodies (13 kDa) se lient à leur cible avec une grande affinité et spécificité en ciblant préférentiellement des cavités.

Thesis resume

G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute one of the largest families of cell surface receptors. Being involved in many physiological processes and diseases such as cancer, neurological disorders, obesity and inflammation, they naturally constitute very important targets in fundamental molecular biology studies, as well as medical and pharmaceutical research fields. GPCRs signal differentially through the family of G proteins and arrestins. In certain contexts, it can be desirable to selectively activate a single pathway. Therefore, significant efforts are deployed to discover compounds that would selectively activate some of the G proteins or arrestins, i.e. so called functionally-selective or biased ligands. To screen for such activities, it is critical to accurately probe the ability of compounds to activate these pathways, and to do so while being as close as possible to physiological conditions. Today a large number of assays are available to study GPCRs. They include the measurement of effector activity or second messengers, such as IP1, Ca2+, cAMP. These strategies have some limitations. First they measure distal events who might be subjected to compartmentalization, amplification. Secondly, some of these signaling pathways can be activated by several G proteins. Other assays are based on ligand binding measurements, using either radioactive or fluorescent compounds. Such assays allow the characterization of the binding site, or G protein activation using GTP analogues. They can well be used with native cells or membranes, but they are limited in terms of throughput analysis and often are difficult to set up in a high through-put format. A possibility is to use G protein fusions with reporter genes allowing bioluminescence resonance energy transfer studies. However, such approaches cannot be used in native cells or membranes. In this study we have set up a method to study GPCR activation using nanobodies. Nanobodies, also called VHH or single domain antibodies, correspond to the variable domain of heavy chain antibodies, a class of antibodies devoid of light chain naturally produced by camelids. In the last decades, they have proven to be highly valuable tools for studying dynamic biological systems. Unlike much larger conventional monoclonal antibodies (150 kDa), nanobodies (13 kDa) bind to their target with high affinity and specificity by targeting grooves and cavities at their surface.