Soutenance de thèse de Richard DESPLANTES

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Neurosciences
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Exosome,SNARE,Botulisme,Neurotoxine,Synapse,SPR
Keywords
Exosome,SNARE,Botulism,Neurotoxin,Synapse,SPR
Titre de thèse
Expression exosomale de protéines synaptiques cibles d’intérêt pharmacologique
Exosomal expression of synaptic proteins: targets with pharmacological interest.
Date
Vendredi 8 Septembre 2017 à 14:00
Adresse
Université Aix Marseille Faculté de Médecine - Secteur Nord 51, Boulevard Pierre Dramard 13015 Marseille
Salle des thèses
Jury
1072 Oussama EL FAR UNIS, INSERM UMR S
Rapporteur Bernard POULAIN INCI, CNRS-UPR3212
Rapporteur Guillaume VAN NIEL CPN, INSERM U-894
Examinateur Nouara YAHI Aix Marseille Université, PPSN-EA 4674
Examinateur Didier HILAIRE Direction Générale pour l'Armement (DGA) MNRBC
Examinateur José BOUCRAUT CRN2M, CNRS UMR 7286

Résumé de la thèse

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sécrétées par des bactéries du genre Clostridium, sont à l’origine du botulisme humain et animal qui se traduit par une paralysie flasque due au blocage de la libération d’acétylcholine à la jonction neuromusculaire. Par ailleurs, ces neurotoxines présentent un intérêt thérapeutique majeur pour le traitement d’affections neurologiques multiples. La BoNT/B se lie et pénètre dans les neurones par l’intermédiaire de deux récepteurs membranaires: la synaptotagmine2 (SYT2) et un poly-sialoganglioside de type GT1b. En utilisant une technologie innovante, j’ai validé l’utilité d’un système permettant de cibler vers les exosomes des protéines recombinantes complexes dont les récepteurs protéiques des BoNTs, Des exosomes exprimant un canal potassium hétérotétramérique, une protéine de type GPCR ou la SYT2 ont été ainsi produits. Des tests de liaison de ligands spécifiques et dépendants d’une conformation native de ces récepteurs ont été réalisés avec succès. La BoNT/B se lie sur des exosomes exprimant la SYT2 en présence de GT1b selon un modèle d’interaction 1 :1, avec une affinité (KD = 0.6 nM) comparable à celle qui est trouvée sur des préparations de terminaisons nerveuses natives. L’expression de protéines membranaires complexes dans des exosomes représente donc une technologie prometteuse pour de nombreuses études pharmacologiques et le développement de nouveaux médicaments. Dans un deuxième volet de ce travail, j’ai montré que la BoNT/B se lie avec une faible affinité et de façon très transitoire sur le GT1b associé à des exosomes et que cette interaction n’est pas détectée dans un contexte cellulaire. En revanche la BoNT/B lie des exosomes exprimant la SYT2 avec une affinité de 40 nM ainsi que la SYT2 transfectée dans des cellules PC12 en culture. La présence de GT1b dans les exosomes SYT2 induit un gain d’affinité d’un facteur 60, essentiellement par un accroissement de la constante cinétique d’association de la BoNT/B. J’ai pu établir que le domaine juxta-membranaire extra cellulaire de la SYT2 lie directement la tête polaire du GT1b avec une affinité de 3 µM, interaction confirmée par modélisation moléculaire. La première lysine du domaine extra cellulaire (K60) est directement impliquée dans l’interaction avec le GT1b et sa mutation affecte la liaison de la BoNT/B sur le complexe SYT2/GT1b. A partir de ces résultats, nous proposons un nouveau modèle de reconnaissance des terminaisons synaptiques par la BoNT/B dans lequel, la toxine interagit avec un co-récepteur SYT2/GT1b préalablement assemblé. Ceci représenterait une première étape déterminante dans la séquence d’évènements conduisant à l’intoxication du neurone.

Thesis resume

Botulinum neurotoxins (BoNTs) are responsible for human and animal botulism and are secreted by bacteria of the genus Clostridium. Intoxication with BoNTs results in flaccid paralysis due to the blockade of acetylcholine release at the neuromuscular junction. BoNTs are also of major therapeutic interest for the treatment of several neurological conditions. To enter neurons, BoNT/B binds two membrane receptors: synaptotagmine2 (SYT2) and GT1b, a poly-sialoganglioside. Using an innovative technology, I validated the utility of a exosomes expressing recombinant forms of several complex membrane proteins, including protein receptors of BoNTs. Recombinant exosomes expressing a hetero-tetrameric potassium channel, a GPCR as well as SYT2 have thus been produced. Specific ligand-binding assays dependent on a native conformational folding of these receptors have been successfully performed. BoNT/B binds to exosomes expressing SYT2 and GT1b according to a 1: 1 interaction model with affinity (KD = 0.6 nM) comparable to that found on native nerve-ending preparations. The expression of complex membrane proteins in exosomes thus represents a promising technology for many pharmacological studies and the development of new drugs. In a second part of this study, I have shown that BoNT/B transiently binds with very weak affinity to GT1b in exosomal membranes and that this interaction is not detected in a cellular context. In contrast, BoNT/B binds to SYT2 on exosomes with an affinity of 40 nM as well as to transfected SYT2 in cultured PC12 cells in the absence of gangliosides. The presence of GT1b in SYT2 exosomes induces a 60-fold increase in BoNT/B affinity, essentially due to an increase in the association constant. I was able to establish that the extracellular juxta-membrane domain of SYT2 directly binds to the polar head of GT1b with an affinity of 3 μM; an interaction confirmed by molecular modeling. The first lysine residue of SYT2 extracellular domain (K60) is involved in this interaction and its mutation affects the binding of BoNT/B to the SYT2 / GT1b complex. On the basis of these results, we propose a new model for synaptic terminal recognition by BoNT/B, in which the toxin interacts with a previously assembled SYT2 / GT1b co-receptor. This would represent the first key step in the sequence of events leading to botulinum neurotoxin poisoning of neurons.