Soutenance de thèse de Martina COTENA

Les nanoparticules de dioxyde de cérium (CeO2 NMs) sont largement utilisées comme additif au diesel et sont libérées dans l'air après la combustion. Lors de la combustion, les propriétés physico-chimiques changent, ce qui souligne la nécessité de mieux comprendre leur toxicité potentielle à chaque étape de leur cycle de vie. Compte tenu des taux croissants de risques pour la reproduction masculine et féminine chez l'homme et la faune au cours des dernières décennies, notre étude vise à comprendre l'effet potentiel de l'exposition à un cocktail de polluants atmosphériques sur les cellules reproductrices des mammifères et des organismes aquatiques. Une approche qui prend en compte des conditions d'exposition très proches de celles attendues chez l'homme. Le premier objectif de ce travail était d'étudier la toxicité reproductive potentielle des CeO2 NMs brûlés sur les cellules germinales ainsi que l'interaction cellulaire des CeO2 NMs. Dans ce cas, des spermatozoïdes humains et de rats ont été exposés in vitro à un additif diesel à base de CeO2 NMs (appelé EnviroxTM), alterés par combustion à 850 °C pour imiter sa libération après combustion dans un moteur diesel. Nous avons démontré des quantités significativement plus élevées de dommages à l'ADN après exposition à la plus faible concentration testée de CeO2 NMs brûlés (1 µg·L-1) en utilisant le test des Comètes (ACA) et une augmentation significative du stress oxydatif dans les spermatozoïdes humains évalué par la sonde H2DCF-DA. L'analyse des images 2D et 3D n'a pas montré d'internalisation des CeO2 NMs brûlés dans le spermatozoïdes humains mais une affinité pour la membrane plasmique de la tête. Notre étude a également examiné l'interaction et la toxicité potentielles des NMs avec d'autres polluants rélargués par les gaz d'échappement des moteurs diesel dans l'air; le benzo(a)pyrène (BaP) est un composé reprotoxique reconnu et l'hydrocarbure aromatique polycyclique le plus étudié dans l'air ambiant; il est émis par la combustion incomplète des combustibles fossiles. Nous avons montré une augmentation significative des dommages à l'ADN après exposition in vitro à des NMs de CeO2 (1 µg·L-1) ou du BaP (1.13 µmol·L-1) brûlés dans des spermatozoïdes humains et des cellules germinales de rats (spermatozoïdes, ovocytes et cumulus) en utilisant l'ACA. La co-exposition au mélange CeO2 NMs-BaP a induit un dommage additif de l'ADN dans les spermatozoïdes et les cellules cumulus; inversement, aucun effet additif n'a été observé dans les ovocytes de rats. Dans un deuxième temps, nous avons examiné l'impact potentiel du rejet de NM dans l'environnement et leurs interactions avec les cellules reproductrices des escargots d'eau douce exposées dans les mésocosmes aquatiques. Nous avons utilisé 60 L d'écosystème de mésocosme intérieur imitant un écosystème d'étang pour étudier les effets d'une exposition chronique de Planorbarius corneus à un cocktail de NMs comprenant 1.1 mg·L-1 de NMs de CeO2 brûlé et 1.1 mg·L-1 de NMs de TiO2 sur 28 jours. Nous avons quantifié le Ce et le Ti dans les sédiments superficiels et les adultes P. corneus. Le Ce a également été trouvé dans les pontes dans la matrice entourant les œufs de P. corneus par ablation laser ICP-MS. Nos résultats donnent un aperçu des mécanismes cellulaires complexes par lesquels les NMs pourraient exercer des effets biologiques sur les cellules reproductrices des mammifères et des invertébrés. Dans les ovocytes de rats, l'absence de génotoxicité additive peut être due à la présence de différentes couches de cellules cumulus qui protègent la cellule et au système efficace de l'ovocyte pour réparer les dommages causés à l'ADN. Cette structure protectrice a également été observée dans les pontes de P. corneus qui semble capturer les NM dans la matrice externe, protégeant ainsi les œufs internes contenus dans une capsule d'œuf. Pour mieux comprendre l'impact de la co-exposition sur la reproduction, des études in vivo sont nécessaires.

Cerium dioxide nanoparticles (CeO2 NMs) are widely used as diesel additive and are released in the air after combustion in a diesel engine. During combustion, the physico-chemical properties drastically change, highlighting the need of a better understanding on their potential toxicity at each stage of their life cycle. Considering rising rates of male and female reproductive hazards in human and wildlife in the last decades, our study aims to better understand the potential effect of exposure to a cocktail of air pollutants on reproductive cells in mammals and aquatic organisms. It represents the first approach considering exposure conditions really close to those expected in human being. The first objective of this work was to study the potential reproductive toxicity of combusted CeO2 NMs towards germ cells as well as the CeO2 NMs cell interaction. Herein, human and rat sperm cells were exposed in vitro to a CeO2 NM-based diesel additive (called EnviroxTM), burned at 850 °C to mimic its release after combustion in a diesel engine. We demonstrated significantly higher amounts of DNA damage after exposure to the lowest concentration tested of combusted CeO2 NMs (1 µg·L−1) using the Alkaline Comet Assay (ACA) and a significant increase of oxidative stress in human sperm evaluated by the H2DCF-DA probe. 2D and 3D image analysis did not show any internalization of combusted CeO2 NMs in human sperm but an affinity for the head plasma membrane. Our study also considered the potential interaction and toxicity of NMs with other pollutants spread by diesel exhaust in the air; benzo(a)pyrene (BaP) is a recognized reprotoxic compound and the most widely investigated polycyclic aromatic hydrocarbon in ambient air; it is widespread by the incomplete combustion of fossil fuels. We showed a significant increase of DNA damage after in vitro exposure to combusted CeO2 NMs (1 µg·L−1) or BaP (1.13 µmol·L-1) in human sperm and rat germ cells (sperm, oocytes and cumulus cells) compared to unexposed cells using the ACA. Co-exposure to the CeO2 NMs-BaP mixture induced additive DNA damage in sperm and cumulus cells; conversely no additive effect was observed in rat oocytes. In a second step we considered the potential impact of the release of NMs in the environment and their interactions with reproductive cells of freshwater snails exposed in aquatic mesocosms. We used 60 L indoor mesocosm ecosystem mimicking a pond ecosystem to study the effects of a chronic exposure of Planorbarius corneus to a cocktail of NMs including 1.1 mg·L-1 of combusted CeO2 NMs and 1.1 mg·L-1 of TiO2 NMs over 28 days. We quantified Ce and Ti in the surficial sediments and adults P. corneus that graze on these sediments to feed. Ce was also found in egg clutches in the matrix surrounding the eggs of P. corneus by Laser Ablation ICP-MS. Our results provide some insight on the complex cellular mechanisms by which NMs could exert biological effects on reproductive cells in mammals and invertebrates. In rat oocytes, the absence of an additive genotoxicity can be due to the presence of different layers of cumulus cells which protect the cell and to the oocyte’s efficient system to repair DNA damages. This protective structure has been also observed in P. corneus egg clutches which seems to capture aggregates of NMs in the external matrix, protecting the internal eggs contained in an egg capsule. To further understand the impact of co-exposure on reproduction, in vivo studies are required.