Soutenance de thèse de Ahmed LOUKIL

La tuberculose latente est une infection chronique asymptomatique qui concerne environ 23% de la population mondiale, elle constitue un des obstacles majeurs au contrôle et à l’élimination de la tuberculose humaine. Dans notre revue de littérature, nous avons constaté que la tuberculose latente est associée à la forme dormante de M. tuberculosis. Il s’agit d’une forme viable, non réplicative qui peut persister dans les tissus de l'hôte pendant plusieurs années sans causer de maladie mais qui peut se réactiver entrainant une tuberculose active. L’examen direct microscopique standard après colorations appropriées, ne permet pas de détecter les formes dormantes de M. tuberculosis. Dans un premier travail, nous avons optimisé la technique microscopique de l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour la détection spécifique des mycobactéries du complexe M. tuberculosis en ciblant leur ADN. L'application de la technique FISH à 116 échantillons d'expectoration a permis de détecter M.tuberculosis dans l'ensemble des 31 échantillons positifs à l’examen direct par Ziehl-Neelsen et positifs en culture, alors que la détection FISH de M. tuberculosis est restée négative dans les 85 échantillons négatifs. La technique FISH a permis également de détecter Mycobacterium bovis BCG dans des sections de biopsie chirurgicale vésicales évocatrices d’une BCGite post instillation vésicale de BCG. En parallèle, nous avons mis en place une méthode totalement originale que nous avons appelée marquage DDD permettant par simple observation microscopique de détecter les trois états dynamique (réplicatif), dormant et mort (dead) de M. tuberculosis. En combinant trois marqueurs fluorescents, le marquage DDD a permis de quantifier les formes DDD chez un patient atteint de tuberculose pulmonaire avant et après initiation du traitement antituberculeux. Les résultats ont montré une diminution significative des mycobactéries dynamiques dans les expectorations du patient après traitement, corrélée à une évolution clinique favorable. Nous avons également démontré la présence d'une population dormante de M. tuberculosis dans les expectorations restées positives en examen direct. Nous avons étendu l’application de ces techniques pour étudier la viabilité d’autres mycobactéries pathogènes pour l’homme en particulier Mycobacterium ulcerans agent étiologique de l’ulcère de Buruli et Mycobacterium leprae responsable de la lèpre. Nous avons démontré l’utilité de la technique FISH pour le diagnostic microbiologique de la lèpre. Nous avons observé une viabilité plus importante des bacilles de lèpre présents dans les sécrétions nasales que dans les tissus cutanés. Également, nous avons établi la preuve expérimentale de l’existence d’une forme dormante chez M. ulcerans. Nos travaux de thèse ont porté aussi sur la réactivation de la tuberculose en émettant l'hypothèse d'un effet direct stimulateur des corticostéroïdes sur le bacille tuberculeux dormant. Pour cela nous avons exposé une souche de M. tuberculosis Beijing en dormance à la méthylprednisolone et au tampon salin comme contrôle négatif et nous avons suivi le réveil de la dormance par culture, microscopie et biologie moléculaire. Les résultats ont montré que la méthylprednisolone à une concentration de 1 µg/mL stimule la croissance des mycobactéries dormantes après remise en culture suggérant un rôle direct dans le réveil de la dormance. Notre travail de thèse a abordé le rôle de la transmission digestive dans l'histoire naturelle de la tuberculose. Nous avons participé à développer un modèle murin d'ingestion de M. tuberculosis par gavage, dans lequel nous avons détecté M. tuberculosis dans les ganglions lymphatiques et les poumons de 8/14 souris et dans la rate de 4/14 souris en recourant aux technique FISH, PCR en temps réel, culture et génomique. Ces résultats ont démontré la capacité de M. tuberculosis ingérée à transloquer du tube digestif vers d'autres organes, en particulier les ganglions lymphatiques.

Latent tuberculosis is a chronic asymptomatic infection that affects approximately 23% of the world's population therefore constitutes one of the major obstacles to the control and elimination of tuberculosis. In our literature review, we found that latent tuberculosis is associated with the dormant form of Mycobacterium tuberculosis. It is a viable, non-replicating form that can persist in host tissues for several years without causing disease but can reactivate, resulting in active tuberculosis. Currently, there is no "gold standard" direct diagnostic test of latent tuberculosis. In a first work, we have optimized the microscopic technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) for the specific detection of M. tuberculosis complex mycobacteria by targeting their DNA which constitutes a stable element regardless of the physiological state of mycobacteria. Application of the FISH technique to 116 prospectively collected sputum specimens resulted in the detection of M. tuberculosis in all 31 Ziehl-Neelsen-positive and culture-positive specimens, while the FISH detection of M. tuberculosis remained negative in the 85 negative specimens. The FISH technique also detected Mycobacterium bovis BCG in surgical bladder biopsy sections suggestive of BCGitis following bladder instillation of BCG as a treatment for bladder cancer. In parallel, we have implemented a totally original method that we have called DDD staining, which allows by simple microscopic observation to detect the three dynamic (replicative), dormant and dead states of M. tuberculosis. By combining three fluorescent markers: fluorescein diacetate, Nile Red and DAPI, the DDD staining allowed us to quantify the DDD forms in a patient with pulmonary tuberculosis before and after initiation of tuberculosis treatment. The results showed a significant decrease in viable dynamic mycobacteria in the patient's sputum after treatment, correlated with a favorable clinical course. We also demonstrated the presence of a dormant population of M. tuberculosis in the patient’s sputum. We have extended the application of these techniques to study the viability of other mycobacteria pathogenic to humans, in particular Mycobacterium ulcerans, the etiological agent of Buruli ulcer, and Mycobacterium leprae, the cause of leprosy. We have demonstrated for the first time the usefulness of the FISH technique for the microbiological diagnosis of leprosy after investigation of 27 skin samples collected from 21 Burkinabe and Ivorian patients suspected of leprosy. We observed a higher viability of leprosy bacilli present in nasal secretions than in skin tissue. Also, we established experimental evidence of the existence of a dormant form in M. ulcerans that would limit its isolation and culture from the ecological niches where this Mycobacterium is detected. Our thesis work has also focused on the reactivation of latent tuberculosis after corticosteroid treatment by hypothesizing a direct stimulating effect of corticosteroids on the dormant tubercle bacillus. For this purpose, we exposed a dormant M. tuberculosis Beijing to methylprednisolone and saline buffer (PBS) as a negative control and monitored the reactivation of the dormancy by culture, microscopy and molecular biology. Results showed that methylprednisolone at a concentration of 1 µg/mL stimulates the growth of dormant mycobacteria after re-culture suggesting a direct role in the awakening of dormancy. Our thesis work addressed the role of digestive transmission in the natural history of tuberculosis. We participated in the development of a mouse model of M. tuberculosis ingestion by gavage, in which we detected M. tuberculosis in the lymph nodes and lungs of 8/14 mice and in the spleen of 4/14 mice using FISH, real-time PCR, culture and genomic techniques. These results demonstrated the ability of ingested M. tuberculosis to translocate from the gastrointestinal tract to other organs, particularly lymph nodes.