Soutenance de thèse de Lidia ZUCCARELLO

Les métalloprotéines jouent un rôle central dans diverses voies métaboliques, couvrant une grande variété de fonctions par la diversité des cations métalliques, des sphères de coordination et des structures spécifiques des centres métalliques. Cette thèse de doctorat porte sur l’étude des relations structure - fonction de différentes métalloprotéines de la cyanobactérie thermophile Thermosynechoccocus elongatus impliquées dans la photosynthèse: ferredoxines à centre [2Fe-2S], cytochromes de type c de coordination Cys/His (PsbV2 et Tll0287), et Photosystème II (PSII), par spectroscopie, et notamment spectroscopie infra rouge, couplée soit à l’électrochimie, soit à la photochimie, dans les domaines infrarouge moyen et lointain. Les propriétés d'une ferredoxine mineure de T. elongatus Fd2 ont été comparées à celles de la ferredoxine principale Fd1, et celles Nostoc PCC7220, FdN. Différents potentiels d’oxydoréduction Em ont été obtenus pour Fd1 (-372 mV) et Fd2 (-440 mV). Une grande similarité de réorganisation structurale a été observée lors de la réduction de Fd1 et de FdN dans les domaines IR moyen et lointain. Des différences significatives ont été observées pour Fd2, notamment concernant les interactions entre le centre [2Fe-2S] et la protéine, révélées par les modes Amide ainsi que par le mode (Fe-St) identifié dans le domaine IR lointain. Les propriétés spécifiques de la ferredoxine mineure Fd2 sont discutées en relation avec le motif CysValAsnCys très différent de celui des ferredoxines principales comme Fd1 ou FdN (CysSerThrCys). Les propriétés de PsbVII et Tll0287 ont été comparées à celles d'un mutant Met58Cys (M58C) du cytc6. Le potentiel d’oxydoréduction (Em) de PsbV2 a été déterminé ainsi que sa dépendance en pH ainsi que celle de M58C. Avec Tll0287, ces cytochromes de type c de coordination axiale His/Cys montrent un Em très négatif de -255 mV, -370 mV et -500 mV, pour M58C, Tll0287 et PsbV2, respectivement, qui diffère beaucoup d’un cytochrome à l’autre. L'importance de l'environnement de l’hème et de la structure de la protéine dans la modulation des propriétés redox a été mise en évidence par spectroscopie IRTF en mode différentiel. Les résultats montrent que la déprotonation du 6e ligand axial, la stabilisation des ligands axiaux dans un environnement électrophile et la présence d'une molécule d'eau très structurée ont un rôle important dans la modulation du potentiel du Em de M58C, Tll0287 et PsbV2, respectivement. Un nouveau marqueur de la coordination axiale His/Cys est proposé dans l'infrarouge lointain entre 289 cm-1 et 303 cm-1, dont la fréquence pourrait être corrélée à la valeur du Em. L’analyse de la transition S1 à S2 dans le PSII a impliqué la mise au point du dispositif de mesure. L'étude d'échantillons H2O, D2O et H218O et de PSII avec du Sr incorporé de façon biosynthétique a permis d’identifier des modes du centre Mn4CaO5 et de molécules d’eau ligands. Ces attributions sont discutées au regard des récentes données structurales, spectroscopiques et de modélisation.

Metalloproteins play a central role in various metabolic pathways of living organisms, covering a large variety of functions by the diversity of the metal cations, coordination spheres, and specific structures of the metal centres. This PhD thesis concerns the relationship between the structure and the function of different metalloproteins of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechoccocus elongatus involved in photosynthesis: plant-type [2Fe-2S] ferredoxins, c-type cytochromes with Cys/His coordination (PsbV2 and Tll0287), and Photosystem II (PSII), using spectroscopic methods, notably Mid- to Far- infrared spectroscopy, coupled to either electrochemistry or photochemistry. The properties of a minor ferredoxin of T. elongatus Fd2 were compared with those of the main ferredoxin Fd1, and that of Nostoc PCC7120 (FdN). Different midpoint potentials were obtained for Fd1 (-372 mV) and the newly purified Fd2 (-440 mV). While high similarity in redox-induced structural changes were evidenced by FTIR difference spectroscopy for Fd1 and FdN, significantly different structural changes were identified for Fd2. Different interactions between the [2Fe-2S] cluster and the protein scaffold, were evidenced by the Amide modes as well as the Far-IR (Fe-St) mode. The specific properties of the minor ferredoxin Fd2 are discussed in relation with its specificity CysValAsnCys motif as compared to that of main ferredoxins as Fd1 (CysSerThrCys). The properties of PsbVII and Tll0287 were compared to those of a Met58Cys mutant (M58C) of cytc6. The oxidation-reduction potential (Em) of PsbV2 was determined as well as its pH dependence and that of M58C. With Tll0287, these His/Cys c-type cytochromes show a very negative Em of -255 mV, -370 mV and -500 mV, for M58C, Tll0287 and PsbV2, respectively, which differs significantly from one cytochrome to another. The importance of the heme environment and protein structure in modulating redox properties was demonstrated by FTIR difference spectroscopy. The results show that deprotonation of the 6th axial ligand, stabilization of the axial ligands in an electrophilic environment and the presence of a highly structured water molecule have an important role in modulating the properties of M58C, Tll0287 and PsbV2, respectively. A new His/Cys axial coordination marker is proposed in the far infrared between 289 cm-1 and 303 cm-1, whose frequency could be correlated with the Em value. The analysis of the S1 to S2 transition in the PSII involved the adaptation of a measurement device. The study of H2O, D2O and H218O samples and PSII with biosynthetically incorporated Sr allowed the identification of IR modes of the Mn4CaO5 centre and ligand water molecules. These attributions are discussed in the light of recent structural, spectroscopic and modelling data.