Soutenance de thèse de Poutoum SAMIRE

Les hydrocarbures (alcanes, alcènes), sont des molécules composées uniquement d'atomes d'hydrogène et de carbone qui font partie intégrante des besoins quotidiens de l'homme. En effet, ils sont les composés de base des carburants et sont utilisés en chimie, comme solvants et lubrifiants, ainsi qu’en cosmétique. La quasi-totalité des hydrocarbures que nous utilisons aujourd'hui sont d'origine fossile mais des voies de biosynthèse d’hydrocarbures à partir des acides gras existent dans de nombreux organismes. Malheureusement, ces enzymes ont souvent un faible rendement et nécessitent des conditions catalytiques difficiles à mettre en œuvre dans l'industrie. Ainsi, la compréhension des mécanismes des enzymes formant des hydrocarbures et leur ingénierie ont fait l’objet de nombreux travaux au cours des dix dernières années. La dernière enzyme formant des hydrocarbures à avoir été découverte (en 2017) est l’acide gras photodécarboxylase (acronyme anglais : FAP), une protéine que l'on ne trouve que dans les algues. Cette enzyme est particulièrement intéressante car sa réaction ne nécessite pas de donneurs d'électrons mais seulement un photon à chaque cycle catalytique. Il s'agit donc d'une photoenzyme, un type d'enzyme très rare. La FAP a suscité beaucoup d'intérêt en biocatalyse. Mon travail de doctorat avait trois objectifs : (i) Déterminer si l'activité de la FAP est conservée dans les algues au-delà de l'algue verte modèle Chlorella variabilis NC64A où elle a été découverte, et voir si d'autres FAP putatives sont susceptibles d'avoir une spécificité d'acide gras différente de la FAP de Chlorella variabilis (CvFAP) ; (ii) Participer à une vaste étude pluridisciplinaire impliquant un consortium international de laboratoires et visant à mieux comprendre la structure et le mécanisme de la CvFAP; (iii) Étudier la spécificité des acides gras de la CvFAP en mettant l'accent sur les acides gras à chaîne courte et moyenne, considérés comme de mauvais substrats pour la FAP. Dans la première partie, j'ai exprimé dans E. coli sept homologues de la CvFAP provenant de divers groupes d'algues et j'ai pu obtenir une FAP active soluble pour quatre d'entre eux : Les FAP d'Ectocarpus siliculosus (macroalgue brune), de Chondrus crispus (macroalgue rouge), de Nannochloropsis gaditana (microalgue proche des algues brunes) et de Galdieria sulphuraria (microalgue rouge) se sont révélées avoir une activité FAP conservée mais avec des spécificités d'acides gras distinctes. Dans la deuxième partie, j'ai participé à la production et à la purification de la CvFAP à grande échelle pour différentes approches biophysiques. J'ai réalisé des expériences biochimiques, de cristallographie statique et de spectroscopie d'absorption transitoire sur la CvFAP et sur un mutant (R451K) important pour la stabilisation du substrat. L'ensemble de l'étude a permis d'élucider tout le mécanisme de la CvFAP. Dans la troisième partie, j'ai étudié l'activité de la CvFAP in vitro et montré qu'elle peut convertir l'acide n-octanoïque quatre fois plus vite que l'acide n-hexadécanoïque, son meilleur substrat rapporté à ce jour. J'ai également montré qu'in vivo, cela se traduit par un taux de production (basé sur la CvFAP) plus de dix fois supérieur pour le n-heptane que pour le n-pentadécane. Les expériences de spectroscopie résolue dans le temps que j'ai réalisées en collaboration ont prouvé que la forte activité catalytique de la FAP sur l'acide n-octanoïque est en partie due à un effet autocatalytique de son produit, le n-heptane, qui remplit le reste de la cavité du site actif de la CvFAP. Enfin, j'ai déterminé l'effet de la concentration en substrat, du pH et de l'intensité lumineuse sur l'activité de la CvFAP pour la conversion des acides n-hexanoïque et n-butanoïque. Ces résultats devraient guider les futures stratégies de sélection, d'amélioration et d'utilisation de la FAP pour la production à la lumière d'hydrocarbures à chaîne courte ou moyenne.

Hydrocarbons (alkanes, alkenes) are molecules composed only of hydrogen and carbon atoms that are an integral part of daily human needs. Indeed, they are the basic compounds of fuels and are used in chemistry, as solvents, lubricants and in cosmetics. Almost all the hydrocarbons we use today are of fossil origin. However, pathways of hydrocarbon biosynthesis from fatty acids exist in many organisms and involve various enzymes. Unfortunately, these enzymes often have low turnovers and require catalytic conditions that are difficult to implement in industry. Thus, the understanding of the mechanisms of hydrocarbon-forming enzymes and their engineering has gained significant interest over the last 10 years. The last hydrocarbon-forming enzyme discovered (in 2017) is fatty acid photodecarboxylase (FAP), a protein found only in algae. This enzyme is particularly interesting because its reaction does not require electron donors but only a photon at each catalytic cycle. It is thus a photoenzyme, a rare type of enzyme. FAP has then attracted a lot of interest, especially for the photoconversion of fatty acids to hydrocarbons. My PhD work had three objectives: (i) Determine whether FAP activity was conserved in algae beyond the model green alga Chlorella variabilis NC64A where it was discovered, and see if some other putative FAP were likely to have a fatty acid specificity different than the FAP from Chlorella variabilis (CvFAP); (ii) Participate in a large multidisciplinary study involving an international consortium of laboratories which aimed at gaining insights into the structure and mechanism of CvFAP; (iii) Study the fatty acid specificity of CvFAP with a focus on short- and medium-chain fatty acids, which were thought to be poor substrates for FAP. In the first part, I have expressed in E. coli seven homologs of CvFAP from various algal groups and be able to obtain soluble active FAP for four of them: FAPs from Ectocarpus siliculosus (a brown macroalga), Chondrus crispus (a red macroalga), Nannochloropsis gaditana (a microalga close to brown algae) and Galdieria sulphuraria (a red microalga) were found to have conserved FAP activity but with distinct fatty acid specificities. In the second part, I have participated to the production and purification of CvFAP on a large scale for different biophysical approaches, performed biochemical, static crystallography and transient absorption spectroscopy experiments on CvFAP and on a mutant (R451K) important for the substrate stabilization. The whole study allowed us to elucidate the complete CvFAP mechanism. In the third part I have studied the activity of CvFAP in vitro and shown that it can convert n-octanoic acid four times faster than n-hexadecanoic acid, its best substrate reported to date. I have also shown that in vivo this translates into a CvFAP -based production rate over ten-fold higher for n-heptane than for n-pentadecane. Experiments of time-resolved spectroscopy I have performed in collaboration have provided evidence that the high catalytic activity of FAP on n-octanoic acid is in part due to an autocatalytic effect of its n-heptane product, which fills the rest of the binding pocket of CvFAP. Finally, I have determined the effect of substrate concentration, pH (and light intensity) on the activity of CvFAP on n-hexanoic and butanoic acids. These results should guide future strategies of FAP selection, improvement and use for a light-driven production of medium- and short-chain hydrocarbons.