Soutenance de thèse de AO ZHANG

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Microbiologie
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Kinase,Phosphorylation,Régulation,protéase,sporulation,
Keywords
Kinase,Phosphorylation,Regulation,protease,sporulation,
Titre de thèse
Caractérisation fonctionnelle de la protéine PrkA chez Bacillus subtilis
functional characterization of the PrkA protein in Bacillus subtilis
Date
Jeudi 15 Décembre 2022 à 14:00
Adresse
cnrs, 31 chemin Joseph Aiguier, 13009, Marseille
Amphitheatre Desnuelle
Jury
Directeur de these Mme Frédérique POMPEO CNRS
Rapporteur Mme Veronique BROUSSOLE INRAE
Rapporteur M. Cedric ORELLE CNRS
Examinateur Mme Emilia MAURIELLO CNRS
Examinateur Mme Anne Marie WEHENKEL Institut Pasteur

Résumé de la thèse

Bacillus subtilis est une bactérie gram-positive qui peut produire des spores en cas de carence nutritionnelle afin de survivre dans des conditions extrêmes. Ce processus de sporulation est très complexe et nécessite une régulaation stricte. La protéine PrkA que j’ai étudiée pendant ma these, s'est révélée être impliquée dans la sporulation. En effet, il a été montré que ΔprkA provoquait un défaut de sporulation important. Je me suis ainsi intéressée d’une part, à la caractérisation biochimique de PrkA et d’autre part, à élucider son role dans le processus de sporulation. Tout d'abord, comme cette protéine avait été prédite comme étant une Ser/Thr kinase, nous avons essayé de confirmer cette activité. La région N-terminale de la protéine contenant un motif Walker A, il a été proposée qu’elle porte une activité ATPase et la région C-terminale contenant des homologies distantes avec des kinases de type Hanks, il a été proposé qu’elle porte une activité kinase. Nous avons pu confirmé l'activité ATPase du domaine N-terminal. Cependant, pour la partie C-terminale de la protéine, ni la caractéristique d'autophosphorylation des kinases de type Hanks, ni la phosphorylation du substrat MBP exogène n'ont pu être trouvées pour PrkA dans diverses conditions. Ces résultats ont permis de poser l’hypothèse qu'il ne s'agissait pas d'une kinase. Dans un second temps, grace à de nouveaux alignements de séquences, nous avons trouvé des similitudes entre les protéases de type Lon et PrkA. Nous avons alors pu montrer que PrkA peut effectivement hydrolyser l'α-caséine, un substrat général de la protéase Lon et que cette activité est dépendante de l'ATP. De plus, nous avons montré que cette activité pouvait être inhibée par l'inhibiteur de protéase PMSF. Nous avons ensuite découvert que PrkA pouvait être phosphorylée par une Ser/Thr kinase de B. subtilis, PrkC, au niveau du résidu T217 (site principal) et éventuellement du résidu S219. La substitution en alanine de chacun de ces deux résidus n'a montré aucun effet sur son activité de protéase in vitro, mais la double substitution a conduit à une activité réduite de PrkA. De plus, la production de PrkA-T217D (protéine phosphomimétique) dans la souche B. subtilis a montré une réduction de la sporulation qui ressemble à celle de la souche ΔprkA alors qu’une souche produisant PrkA-T217A (protéine phosphoablative) avait un taux de sporulation similaire à celui de la souche de type sauvage. Nous avons donc démontré pour la première fois que PrkA porte une activité protéasique nécessaire à la sporulation de B. subtilis et que la phosphorylation de PrkA régule son activité. Enfin, nous avons aussi essayé de trouver des substrats de PrkA. Avec les informations de co-occurrence et de réseau fonctionnel putatif, les protéines YhbH, SpoVR et ScoC ont été prédites comme des candidats potentiels. En utilisant la méthode du double-hybride, nous avons confirmé l'interaction entre PrkA et tous ces candidats. Mais les expériences de coimmunoprécipitation et de colocalisation n’ont pas permis de valider ces interactions. De plus, aucune dégradation de ces protéines par l’activité protease de PrkA n'a été observée. Dans le cas de ScoC, qui est un régulateur traductionnel de δK et qui a été décrit comme lui-même régulé par PrkA, nous n'avons pu montrer aucun effet d'une protéine sur l'autre: les activités de PrkA ne sont pas modifiées par l’ajout de ScoC, et PrkA n'a pas n'affecte pas la liaison de ScoC à l'ADN. Cela suggère donc que PrkA régulerait ScoC de manière indirecte. Dans l'ensemble, au cours de ma thèse, j'ai montré que PrkA n'est pas une Ser/Thr kinase typique mais une protéase dépendante de l'ATP, potentiellement de la famille des protéases Lon. De plus, PrkA peut être phosphorylée par PrkC au niveau d'un résidu T217 et cette phosphorylation pourrait être nécessaire pour la régulation de l'activité de la protéine PrkA pendant la sporulation.

Thesis resume

Bacillus subtilis is a gram-positive bacterium which can produce spores upon starvation to survive through extreme conditions. This sporulation process is very complex and needs tight regulations. PrkA protein was proved to be involved in sporulation. It has been shown that ΔprkA caused a significant sporulation deficiency. Here, we furtherly characterize its function and activity during sporulation. Firstly, as this protein was firstly predicted to be a Ser/Thr kinase, we tried to confirm this activity. As the N-terminal region containing a conserved Walker A motif was proposed to carry an ATPase activity and the C-terminal region containing distant homologies with Hanks-type kinases was proposed to carry the kinase activity. We confirmed that the N-terminal ATPase activity and that it’s also able to bind GTP. But for the C-terminal part of the protein, nor the autophosphorylation characteristic of Hanks-type kinases, nor the phosphorylation of the exogenous MBP substrate could be found for PrkA protein within various conditions. Taken these together, we then thought it is not a kinase. We constructed a ΔprkA strain and a walker A-mutated strain. These two strains caused a similar reduction of sporulation rate. We confirmed the function of PrkA by the complementation of its gene deletion by the expression of prkA from the ectopic amyE locus that was able to totally restore the sporulation ability. Then, we mainly focused on understanding the role of PrkA in sporulation. By new sequence alignments, we found similarities between PrkA and Lon proteases. This is in line with the previous results because Lon proteases are ATP-dependent enzymes which usually have ATPase and protease activities. We could then show that PrkA can indeed hydrolyze α-casein, a general substrate of Lon protease and that this activity was ATP-dependent. Moreover, this activity could be inhibited by the protease inhibitor PMSF. We next discovered that PrkA could be phosphorylated by PrkC kinase at the T217 residue (main site), and possibly the S219 residue. Alanine substitution for these two single residues showed no effects to its protease activity in vitro, but the abolishment of these two residues together caused a reduced activity. The production of PrkA-T217D (phosphomimetic protein) in B. subtilis strain showed a reduction of sporulation which resembles to that of ΔprkA strain. While the strain producing PrkA-T217A (phosphoablative protein) had a similar sporulation rate to that of wild type strain. We therefore demonstrated for the first time that PrkA carries a protease activity needed for the sporulation of B. subtilis and that the phosphorylation of PrkA regulates its activity during sporulation. We also tried to find its substrates. With the co-occurrence and putative functional network information, YhbH, SpoVR and ScoC proteins were predicted to be potential candidates. Using the two-hybrid method, we confirmed the interaction between PrkA with all these candidates. But coimmunoprecipitation and colocalization experiments could not support these interactions. Furthermore, no degradation of these proteins by PrkA was observed. In the case of ScoC, which is a translational regulator of δK and that was proved to be regulated by PrkA, we were not able to show any the effect of one protein on the other: PrkA activities are not modified by ScoC, and PrkA didn’t affect ScoC binding to DNA. So, this suggests that PrkA may regulate ScoC through an indirect way. Taken together, during my thesis, I showed that PrkA is not a typical Ser/Thr kinase but is an ATP-dependent protease, possibly a Lon protease. Moreover, PrkA could be phosphorylated by PrkC at a main site T217 residue. Importantly, this phosphorylation could also be necessary for the regulation of PrkA protein activity during sporulation.