Soutenance de thèse de LAMIA MEBARKI

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie - Spécialité Biochimie structurale
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
domaine variable d’anticorps à chaine lourde des camelidés (VHH),modulateur pharmacologique,récepteur à la vasopressine V1b (V1bR),récepteur à la sérotonine 5HT3 (5HT3R),toxine de venin de serpent,voie métabolique,
Keywords
Camelidae single-domain antibody fragment (VHH),metabolic pathway,pharmacological modulator,snake venom toxin,vasopressine V1b receptor (V1bR),5HT3 serotonin receptor (5HT3R),
Titre de thèse
Recherche ou développement, et caractérisation fonctionnelle et structurale d’effecteurs peptidiques de deux récepteurs membranaires à incidences physiopathologiques
Research or development, and functional and structural characterization of peptidic effectors of two membrane receptors with pathophysiological incidences
Date
Mardi 3 Octobre 2017 à 14:00
Adresse
Faculté des Sciences de Luminy Aix-Marseille Université 163 av. de Luminy 13288 Marseille cedex 09
Amphi 12 - Bat B
Jury
Rapporteur Jean-Louis BANERES Institut des Biomolécules Max Mousseron, Montpellier
Rapporteur Denis SERVENT Institut de Biologie et de Technologies de Saclay, Gif sur Yvette
Examinateur James STURGIS Institut de Microbiologie de la Méditerranée, Marseille
Examinateur Pierre Edouard BOUGIS Centre de Recherche en Neurobiologie et Neurophysiologie de Marseille

Résumé de la thèse

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) constituent une grande famille de récepteurs impliqués dans de nombreux processus de signalisation cellulaire. Le récepteur à la vasopressine V1b (V1bR), est impliqué dans la dépression, le stress, et la sécrétion d’insuline dans les ilots de Langerhans. Des ligands affins et sélectifs du V1bR pourraient donc être utilisés comme outils pharmacologiques et/ou agents thérapeutiques. Jusqu’à présent, les anticorps monoclonaux conventionnels n’ont pas permis de cibler efficacement des GPCRs. En revanche, le domaine variable des anticorps à chaînes lourdes (VHH) présents dans le sang des camélidés présente plusieurs avantages par rapport aux anticorps classiques. Au cours de ma thèse, j’ai développé et caractérisé aux plans biochimique et fonctionnel plusieurs VHHs dirigés contre le V1bR humain (hVIbR. Je montre que l’un d’entre eux, le VHH10, agit comme un agoniste allostérique complet et spécifique du hV1bR. En effet, le VHH10 est capable d’activer les voies de signalisation de l’inositol phosphate et des MAP kinases in vitro, et d’induire l'internalisation du hV1bR exprimé dans des lignées cellulaires. De plus, l’ajout du VHH10 à des îlots pancréatiques surexprimant le hV1bR induit une augmentation de la concentration du Ca2+ intracellulaire et une sécrétion d'insuline via l’activation du V1bR. Le VHH10 pourrait donc être utilisé pour localiser la distribution tissulaire du V1bR et comprendre sa fonction, et pour moduler la sécrétion d’insuline dans le cas du diabète. Couplé à une drogue, il pourrait être utilisé pour traiter certains cancers, comme la tumeur sécrétrice d’ACTH de l’hypophyse. En conclusion, le VHH10 est le premier VHH à être caractérisé comme un agoniste d’un GPCR, capable d’en moduler la fonction in vitro. Les récepteurs à la sérotonine de type 3 (5-HT3Rs) sont des canaux ioniques ligand-dépendants de la famille des récepteurs à boucle Cys présents dans les systèmes nerveux central et périphériques. Il existe cinq types de sous-unités (de A à E) et tous les 5-HT3R fonctionnels contiennent au moins une sous-unité A. Les autres sous-unités peuvent être identiques (homopentamère 5-HT3R A) ou différentes (hétéropentamères, dont le mieux connu est le 5-HT3R AB), ce qui génère des récepteurs de propriétés pharmacologiques distinctes. Les agonistes ou modulateurs positifs organiques identifiés à ce jour ont une faible sélectivité et génèrent des effets secondaires délétères, ce qui limite leur utilisation en recherche fondamentale ou à des fins thérapeutiques. Les venins de serpents constituent de vastes bibliothèques naturelles de molécules peptidiques présentant une grande variété de structures moléculaires et d'activités pharmacologiques. En utilisant des formes recombinantes et solubilisées des 5-HT3R A et AB de souris, et en combinant des approches de détection d’interaction par résonance plasmonique de surface, purification par chromatographie liquide, et identification par spectrométrie de masse, j’ai criblé 31 venins de serpents différents et, dans l’un d’eux, identifié une toxine peptidique déjà caractérisée comme une enzyme à activité Ca2+-dépendante. En utilisant des mutants de cette toxine, j’ai pu montrer qu’elle se fixe aux 5-HT3R A et AB de souris de façon indépendante du Ca2+ et avec des valeurs de Kd ≤ 10 nM, et prédire sa surface d’interaction. Des données fonctionnelles enregistrées par électrophysiologie (voltage-clamp) sur récepteurs exprimés à la surface d’ovocytes suggèrent que la toxine agit comme un modulateur allostérique positif de l’activité canal ionique. Enfin, des images de microscopie électronique en coloration négative montrent que la toxine se fixe sur le domaine extracellulaire du 5-HT3R, en un site distinct du site de fixation de la sérotonine. En conclusion, nous avons mis en évidence un nouveau récepteur pour une « ancienne » toxine peptidique, qui pourrait s’avérer un nouvel outil moléculaire pour étudier, et activer,les 5-HT3R.

Thesis resume

G-protein-coupled receptors (GPCRs) constitute a large family of receptors involved in many cell signaling processes. The vasopressin receptor V1b (V1bR) is involved in depression, stress, and insulin secretion in the islets of Langerhans. Affine and selective ligands of V1bR could therefore be used as pharmacological tools and/or therapeutic agents. Until now, conventional monoclonal antibodies have not been found to target GPCRs successfully. In contrast, the variable domain (VHH) of heavy chain antibodies present in the blood of camelidaes has several advantages over classical antibodies. During my thesis work, I developed and characterized biochemically and functionally several VHHs directed against the human V1bR (hV1bR). I show that one of them, VHH10, acts as a complete, hV1bR-specific allosteric agonist. Indeed, VHH10 is able to activate the signaling pathways of inositol phosphate and MAP kinases in vitro and to induce the internalization of hV1bR expressed in cell lines. In addition, the addition of VHH10 to pancreatic islets overexpressing hV1bR enhances the intracellular Ca2+ concentration and insulin secretion via V1bR activation. VHH10 could therefore be used to localize the tissue distribution of V1bR and understand its function, and to modulate insulin secretion in diabetes. Coupled with a drug, it could be used to treat some cancers, such as the ACTH secreting tumor of the pituitary gland. In conclusion, VHH10 is the first VHH to be characterized as an agonist of a GPCR, able to modulate its function in vitro. Type 3 serotonin receptors (5-HT3R) are ligand-gated ion channels of the Cys loop receptor family, present in the central and peripheral nervous systems. There are five 5-HT3R subunits (A–E), and all functional receptors require at least one A subunit. The other subunits may be identical (homopentameric 5-HT3R A) or different (heteropentamers, of which the 5-HT3R AB is the best characterized), a feature that generates receptors with distinct pharmacological properties. The organic ligands acting as agonists or positive modulators identified to date have low selectivity and generate deleterious side effects which limit their use in basic research or as therapeutic tools. Snake venoms are large natural libraries of peptidic molecules with a wide variety of molecular structures and pharmacological activities. By using recombinant and solubilized forms of mouse 5-HT3R A and AB, and by combining approaches of detection of interactions by surface plasmon resonance, purification by two chromatography methods, and identification by mass spectrometry, I screened 31 different snakes venoms and identified in one of them a peptidic toxin previously characterized as an enzyme with Ca2+-dependent activity. Using mutants of this toxin, I could show that it binds to the mouse 5-HT3R A and AB in a Ca2+-independent manner and with Kd values ≤ 10 nM, and predict its interaction surface. Functional data recorded by electrophysiology (voltage-clamp) on receptors expressed at the surface of oocytes suggest that the toxin acts as a positive allosteric modulator of ion channel activity. Finally, negative stain electron microscopy images show that the toxin binds to the extracellular domain of 5-HT3R, at a site distinct from the serotonin binding site. In conclusion, we evidenced a new receptor for an "old" peptidic toxin, which could be used as a new molecular tool for studying, and activating, the 5-HT3Rs.