Soutenance de thèse de Violla ABDALLAH BASSIM

Pseudomonas aeruginosa (PA) est un pathogène opportuniste qui infecte les patients immunodéprimés et ceux atteints de la mucoviscidose. PA peut provoquer des infections aiguës et chroniques et a été déclaré comme un pathogène à haut risque avec la nécessité de trouver de nouveaux antibiotiques. PA peut alterner entre des modes de vie planctonique et sédentaire associé au biofilm. Cette transition est principalement régulée par les systèmes à deux composants. Au cours de ma thèse, mon étude s’est focalisée sur GacS/GacA, qui s’active durant les stades précoces de la formation du biofilm. GacS est une histidine kinase non orthodoxe liée à la membrane (HK) et GacA est son régulateur de réponse (RR). La région cytoplasmique de GacS est composée du domaine HAMP et S-Hélice. Cette région hélicoïdale est suivie par le domaine H1 (qui contient les sous-domaines DHp et CA), les domaines D1 et H2. GacS/GacA est impliqué dans un réseau multikinase et son activité est modulée par trois HKs, LadS, PA1611 et RetS. Des analyses structurales et fonctionnelles ont été effectuées afin de décortiquer les déterminants moléculaires de cette voie de signalisation. Des tests fonctionnels ont montré que la région HAMP et S-Hélice orchestre la transduction du signal dans GacS pour assurer par la suite son activité autokinase. GacS présente un site de fixation de l’ATP bien structuré contrairement à ce qui est observé dans d'autres HKs sous leur forme apo. De plus, un nouveau domaine (ND) situé entre les domaines H1 et D1 a été annoté. Des analyses fonctionnelles ont montré que le domaine ND est obligatoire pour assurer une activité autokinase complète de GacS, mais pas dans la liaison du ligand. Par conséquent, nous avons proposé que ce domaine contribue à des réarrangements conformationnels pour placer GacS dans sa configuration asymétrique et active. RetS inhibe GacS par des interactions directes entre leurs régions cytoplasmiques. Des tests de spectrométrie de masse native et des tests d’interaction ont montré que le domaine HAMP est nécessaire pour l'interaction GacS et RetS avec une stœchiométrie 1:1. De plus, des anticorps contre GacS ont été générés et caractérisés afin de surmonter le problème de flexibilité de la région cytoplasmique dans la cristallisation. Le mode de fixation de ces anticorps a révélé des sites potentiels d'inhibition de l'activité GacS et de la formation de biofilm. Dans cette étude, nous avons dévoilé une activité autokinase non canonique de GacS et de nouvelles perspectives sur son interaction avec RetS qui contribuent au processus décisionnel pendant l'infection par PA.

Pseudomonas aeruginosa (PA) is an opportunistic pathogen that mainly infects immunocompromised patients and those with cystic fibrosis. PA causes acute and chronic infections and has developed resistance mechanisms. It was declared by the CDC as a high risk pathogen with the urge to find new antibiotics. PA can switch from a planktonic to a sedentary lifestyle associated with biofilm formation. This transition is mainly coordinated by Two-Component Systems (TCS). During my thesis, I focused on GacS/GacA which is a master regulator of the acute-to-chronic transition and activated during early stages of biofilm. In fact, GacS is a membrane-bound histidine kinase (HK) and GacA is the cognate response regulator (RR). GacS is an unorthodox HK. Its cytoplasmic region is composed by the HAMP, S-Helix coiled-coil region. This helical part is followed by the H1 domain (that contains the DHp and the CA subdomains), the D1 and H2 domains. GacS/GacA TCS is involved in a multikinase network and its activity is modulated by three HKs LadS, PA1611 and RetS. Structural and functional assays were done in order to decipher the key molecular determinants of this pathway. Mutagenesis and functional assays showed that the HAMP and S-Helix coiled-coil region orchestrate the signal transduction within GacS prior to its autokinase activity. In addition, GacS presented a folded ATP lid in contrast to what is observed in other HKs in their apo form. Furthermore, we unveiled a new domain (ND), located between the H1 and the D1 domains, which was not annotated in GacS sequence. Functional assays showed that the ND domain is mandatory to insure a full autokinase activity of GacS, but not in ligand binding. Therefore, we proposed that this domain contributes in conformational rearrangements in order to shift GacS from its symmetric, inactive configuration to the active, asymmetric one. RetS is known to inhibit GacS/GacA via direct interactions between their cytoplasmic regions. Native mass spectrometry and microscale thermophoresis assays showed that the HAMP domain is compulsory for GacS and RetS interaction, which occurs in a 1:1 stoichiometry. Furthermore, nanobodies against the cytoplasmic region of GacS were generated and characterized in order to overcome the flexibility limitation in crystallization. The mode of attachment of these antibodies revealed potential sites of inhibition of GacS activity and biofilm formation. In this study, we unveiled a non-canonical autokinase activity in GacS and new insights into its interaction with RetS that contribute to the decision-making process during PA infection.