Soutenance de thèse de Thi-Tuyet-NHUNG LE

Les coronavirus (CoVs, sous-famille des Coronavirinae, famille des Coronaviridae, ordre des Nidovirales) sont des virus à ARN simple brin à sens positif qui infectent les humains et les animaux. Les CoVs sont la cause la plus fréquente de maladies respiratoires et entériques. Au cours des 18 dernières années, l'émergence successive de CoV hautement pathogènes tels que le syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV) en 2003 et le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) en 2012 a montré clairement que les CoV représentent une menace potentielle pour la santé humaine. Ils suivent un mécanisme complexe de réplication et de transcription pour produire l'un des plus grands génomes d'ARN (27-32 kb) de virus connus. Toutefois, les études biochimiques de complexes de polymérases SARS-CoV ont été fortement entravées par les difficultés rencontrées lors des tentatives d'expression stable et de purification sur des quantités équitables de complexe de polymérase actif. Mon projet de doctorat décrit dans cette thèse était la caractérisation structurelle et fonctionnelle de ce complexe. Nous avons d'abord reconstitué un RTC hautement actif avec l'ARN polymérase dépendante de l'ARN (RdRp) nsp12 purifiée individuellement et son facteur de transformation nsp7-nsp8. En utilisant des analyses biochimiques, nous montrons que ce complexe de polymérase présente une faible fidélité sans l'aide de l'activité d'excision de l'Exonucléase (ExoN) de nsp14. Le SARS-CoV semble utiliser un mécanisme unique de correction de l'ARN impliquant le RdRp nsp12 et l'ExoN nsp14 qui n'a jamais été décrit dans aucun virus à ARN. Il montre également que ce complexe est capable de catalyser la formation de liaisons phosphodiester à un rythme plus rapide que tout autre RdRp viral connu à ce jour, ainsi qu'avec des taux d'erreur élevés pour l'incorporation du NTP, en particulier pour l'UTP. Le RTC du SRAS-CoV incorpore facilement les 5'-triphosphates de Ribavirine, de 5-Fluorouracil et de de-fluoro Favipiravir-ribose dans l'ARN. Étant donné que l'exonucléase nsp14 est capable d'éliminer à la fois les mésappariements de l'extrémité 3' et les analogues nucléotidiques, nos résultats suggèrent que les meilleures propriétés anti-SARS-CoV peuvent être obtenues avec des nucléotides mutagènes qui ne sont pas discriminés sur le site actif nsp12. L'absence de traitement médicamenteux efficace contre les CoVs souligne la nécessité d'élucider leurs mécanismes de réplication et d'identifier des cibles médicamenteuses potentielles pour le traitement de l'infection par les CoVs. Notre résultat pourrait ouvrir la voie à la mise au point de nouveaux antiviraux contre ce virus.

Coronaviruses (CoVs, subfamily Coronavirinae, family Coronaviridae, order Nidovirales) are positive-sense single-stranded RNA viruses that infect humans and animals and are the most common cause of respiratory and enteric diseases. Over the past 18 years, the successive emergence of highly pathogenic CoVs such as the Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS-CoV) in 2003 and the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) in 2012 made it clear that CoVs show a potential threat to human health. They follow a complex replication and transcription mechanism to replicate one of the known largest RNA genome (27-32kb) of viruses. However, the biochemical studies of SARS-CoV polymerase complex have been greatly hampered by difficulties to stably express and purify fair amounts of active polymerase complex. My PhD project described in this thesis was the structural and functional characterization of this complex. We first reconstitute a highly active RTC with individually purified RNA dependent RNA polymerase (RdRp) nsp12 and its processive factor nsp7-nsp8. By using biochemical assays, we show that this polymerase complex exhibits low fidelity without the help of Exonuclease (ExoN) excision activity of nsp14. SARS-CoV seems to use a unique RNA proofreading mechanism involving the RdRp nsp12 and the ExoN nsp14 that has never been described in any RNA virus. It also shows that this complex is able to catalyze phosphodiester bond formation at a faster rate than any other viral RdRp known so far, as well as with high error rates for NTP incorporation, in particular for UTP. The SARS-CoV RTC readily incorporates 5'-triphosphates of Ribavirin, 5-Fluorouracil, and de-fluoro Favipiravir-ribose into RNA. Since the nsp14 exonuclease is able to remove both 3'- terminus mismatches and nucleotide analogues, our results suggest that best anti-SARS-CoV properties may be achieved with mutagenic nucleotides that are not discriminated at the nsp12 active-site. The lack of effective drug treatment against CoVs highlights the need for elucidating their replication mechanisms and identifying potential drug targets for treatment of CoVs infection. Our result may paves the wave to develop new antivirals against this virus.