Soutenance de thèse de Marta MONTSERRAT GOMEZ

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Oncologie
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
VANGL2,Proteine de membrane,Domain PDZ,Motif de liaison PDZ (PBM),Polarité cellulaire,Affinité d'interaction des protéines
Keywords
VANGL2,membrane protein,PDZ domain,PDZ Binding Motif,Cell polarity,Protein interaction affinity
Titre de thèse
Caractérisation moléculaire et fonctionnelle du motif de liaison PDZ (PBM) de la protéine de polarité cellulaire planaire (PCP) VANGL2
Molecular and functional characterization of the PDZ-binding motif (PBM) of the planar cell polarity (PCP) VANGL2 protein
Date
Jeudi 16 Juillet 2020 à 14:00
Adresse
Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille (CRCM) Inserm, CNRS, Aix-Marseille Université, Institut Paoli-Calmettes27 bd Leï Roure    BP 3005913273 MARSEILLE CEDEX 09 France
Salle de visioconference CRCM
Jury
Directeur de these M. Jean-paul BORG Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille (CRCM)
Rapporteur Mme Mireille MONTCOUQUIOL Universite de Bordeaux Segalen
Rapporteur M. Nicolas WOLFF Institut Pasteur
CoDirecteur de these M. Eric BAILLY Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille (CRCM)
Examinateur M. Gilles TRAVé Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire-IGBMC
Examinateur M. Xavier MORELLI Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille (CRCM)

Résumé de la thèse

VANGL2 est un composant central de la voie dite de polarité cellulaire planaire, identifiée pour la première fois chez Drosophila melanogaster. VANGL2 est remarquablement bien conservé phylogénétiquement et possède un paralogue étroitement apparenté, VANGL1. VANGL2 a un rôle central au cours du développement embryonnaire, assurant la médiation des mouvements d'extension convergents nécessaires à la bonne fermeture du tube neural ou des vertébrés. Il coordonne également l'orientation du motif de fourrure chez la souris, la bonne orientation des stéréocils dans l'oreille interne. Des études récentes ont établi un lien entre l'expression de VANGL2 et la biologie du cancer. Les protéines Vang/Vangl contiennent quatre domaines transmembranaires, un motif d'interaction C-terminal pour les domaines PDS95 / Disc large / Zonula occludens (PDZ) et un site de liaison PDZ interne non conventionnel. Les domaines PDZ sont parmi les domaines modulaires les plus abondants trouvés dans le protéome des métazoaires dans lesquels ils assurent la médiation d'une myriade d'interactions protéine-protéine ainsi que protéine-lipide. Dans le présent travail, j'ai déchiffré la complexité du réseau VANGL2-PDZ et étudié la biochimie de l'interaction pour aborder l'importance fonctionnelle du motif de liaison conventionnel VANGL2 PDZ (PBM). À cette fin, j'ai examiné une nouvelle version du PDZome humain (hPDZome V.2) par Yeast Two-Hybrid (Y2H) et par une méthode de rétention biochimique à haut débit, avec différents fragments de Vangl2 comme appâts. Par ces approches orthogonales, j'ai pu cartographier l'intégralité de l'interactome VANGL2-PDZ humain et valider un sous-ensemble de ces interactions en utilisant différentes approches biophysiques. J'ai ensuite analysé plus en profondeur les caractéristiques de liaison PDZ de VANGL2 en mesurant l'affinité de son PBM C-terminal pour divers domaines PDZ. Plus précisément, j'ai utilisé un test de polarisation de fluorescence combiné à une approche par réseau de points pour étudier la contribution de chaque résidu du PBM VANGL2 à l'interaction avec trois liants PDZ: DLG1-PDZ1-2, SNX27-PDZ et SCRIB PDZ3. J'ai pu non seulement déterminer la longueur minimale du VANGL2 PBM requise pour son interaction PDZ, mais aussi identifier les résidus les plus importants impliqués dans ces interactions. De plus, j'ai pu établir que la phosphorylation de Thr et Ser dans la séquence ETSV PBM de VANGL2 réduit fortement son interaction PDZ. Des études cytologiques menées avec des constructions ΔPBM VANGL2 exprimées ectopiquement ou avec des lignées de cellules épithéliales de souris perturbées pour le PBM de VANGL2 par une approche CRISPR Cas9 démontrent toutes deux que le PBM de VANGL2 a étonnamment peu d'impact sur la localisation ou le transport de la protéine vers la membrane plasmique . Conformément à cela, les études sur la perte de fonction (siARN) de différentes protéines PDZ ne montrent aucun effet sur l'expression ou la localisation de VANGL2.

Thesis resume

VANGL2 is a core component of the so-called planar cell polarity pathway, first identified in Drosophila melanogaster. VANGL2 is remarkably well conserved phylogenetically and possesses a closely related paralog, VANGL1. VANGL2 has a central role during embryonic development, mediating the convergent extension movements required for the proper closure of the neural tube or vertebrates. It also coordinates the orientation of the fur pattern in mice, the proper orientation of stereocilia in the inner ear. Recent studies have established a link between VANGL2 expression and cancer biology. Vang/Vangl proteins contain four transmembrane domains, a C-terminal interaction motif for PDS95/Disc large/Zonula occludens (PDZ) domains and a non-conventional internal PDZ binding site. PDZ domains are among the most abundant modular domains found in the proteome of metazoans in which they mediate a myriad of protein-protein as well as protein-lipid interactions. In the present work, I deciphered the complexity of the VANGL2-PDZ network and studied the biochemistry of the interaction to address the functional importance of the conventional VANGL2 PDZ binding motif (PBM). To this end, I screened a new version of the human PDZome (hPDZome V.2) by Yeast Two-Hybrid (Y2H) and by a high throughput biochemical holdup method, with different Vangl2 fragments as baits. By these orthogonal approaches I could map the whole human VANGL2-PDZ interactome and validate a subset of these interactions using different biophysical approaches. I then analysed more in depth the PDZ binding characteristics of VANGL2 by measuring the affinity of its C-terminal PBM for various PDZ domains. More specifically, I used a fluorescence polarization assay combined with a spot array approach to investigate the contribution of each residue of the VANGL2 PBM to the interaction with three PDZ binders: DLG1-PDZ1-2, SNX27-PDZ and SCRIB PDZ3. I could not only determine the minimal length of the VANGL2 PBM required for its PDZ interaction but also identify the most important residues involved in these interactions. In addition I could establish that Thr and Ser phosphorylation in the ETSV PBM sequence of VANGL2 strongly reduces its PDZ interaction. Cytological studies conducted with ectopically expressed ∆PBM Vangl2 constructs or with mouse epithelial cell lines disrupted for the PBM of Vangl2 by a CRISPR Cas9 approach both demonstrate that the PBM of Vangl2 has surprisingly little impact on the localization or transport of the protein to the plasma membrane. Consistent with this, loss-of-function studies (siRNA) of different PDZ proteins fail to show any effect on Vangl2 expression or localization.