Soutenance de thèse de Robert ROELLIG

Ecole Doctorale
SCIENCES CHIMIQUES - Marseille
Spécialité
Sciences Chimiques
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Monooxygénase à flavine,Systèmes enzymatiques à deux composants,Type II Baeyer-Villiger Monooxygenase,Transfert d'hydrure,Oxydation de Baeyer-Villiger,Epoxydation
Keywords
Flavoprotein Monooxygenase,Two-component enzyme,Type II Baeyer-Villiger Monooxygenase,Hydride-transfer,Baeyer-Villiger oxidation,Epoxidation
Titre de thèse
Monooxygénases à flavine à deux composantes: Quelles solutions pour le transfert d'hydrures lors de réactions biocatalysées
Flavin Dependent Monooxygenases of Two-Component Systems: what solutions to the Hydride Transfer in the biocatalytic reactions?
Date
Wednesday 6 October 2021
Adresse
Aix Marseille University Campus Saint-Jérôme - 52 Avenue Escadrille Normandie Niemen, 13013 Marseille
Salle des thèses
Jury
Directeur de these Mme Véronique ALPHAND CNRS / AMU iSm2
Examinateur M. Thomas William SEVIOUR Department of Biological and Chemical Engineering - Aarhus University
Examinateur M. Thierry TRON CNRS / Aix Marseille Université
Rapporteur M. Willem VAN BERKEL Wageningen University and Research
Rapporteur M. Jan DESKA Department of Chemistry - Aalto University
Directeur de these Mme Selin KARA Aarhus Université

Résumé de la thèse

Les monooxygénases flavoprotéiques à deux composants sont formées d'une enzyme réductase et d'une oxygénase. La preuve de la fonctionnalité de cette dernière sans son homologue ainsi que le mécanisme de transfert de la flavine à démonter. Pour répondre à cette question, nous avons utilisé un système de réaction sans réductase en appliquant la 2,5-dicétocamphane-monooxygénase I (2,5-DKCMO) purifiée, une Baeyer-Villiger monooxygénase type II, FMN dépendante et des analogues synthétiques du cofacteur nicotinamide (NCBs), des dérivés de la dihydropyridine, pour la réduction du FMN. Ce système a démontré l'autonomie de l'oxygénase, ainsi que du mécanisme de transport du FMNH2 par libre diffusion. L'efficacité de ce système sans réductase dépend fortement de l'équilibre entre la réduction du FMN et la (ré)oxydation enzymatique, car le FMN réduit en solution provoque des réactions secondaires indésirables, comme la formation de peroxyde d'hydrogène. Des études par plans d'expériences nous ot permis i) d'étudier l'effet de divers paramètres de réaction, soulignant l'importance de l'équilibre du cycle FMN/FMNH2, ii) d'optimiser le système réactionnel pour la réaction de Baeyer-Villiger enzymatique sur la bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one, le camphre et le norcamphre racémiques. Enfin, cette étude démontre non seulement l'indépendance de la 2,5-DKCMO vis-à-vis de la réductase, mais revisite également la terminologie des monooxygénases flavoprotéiques à deux composants pour ce cas spécifique. La température est un paramètre crucial pour les processus biologiques et chimiques. Son effet sur les réactions catalysées par voie enzymatique est connu depuis des décennies, et la stéréo- et l'énantiopréférence sont souvent dépendantes de la température. Nous présentons ici pour la première fois l'effet de la température sur la réaction de BV enzymatique dans les conditions précédentes. La modélisation en langage SLM a été utilisée pour mettre en évidence cet effet, qui ne pouvait être quantifié avec des methodes « classiques » telles que la determination de la valeur E (coefficient d’énantiosélectivité)) en raison de la complexité du système. Nous avons ainsi montré que l'énatiopréférence de la 2,5-DKCMO diminue lorsque la température augmente. L'un des plus grands défis pour l’usage des flavoprotéines à deux composants est de disposer d’un système de régénération efficace pour le cofacteur flavinique. En tirant parti de la capacité du complexe [Cp*Ir(bpy-OMe)H]+ à transférer des hydrures dans un large domaine de pH, nous avons étendu le champ d'application à la 2,5-DKCMO dans un premier temps. L’utilisation du complexe d’iridium a accéléré de 90 fois la réaction déclenchée par le NADH et a permis l'utilisation de l'acide formique comme co-substrat peu coûteux. Nous démontrons que cette preuve de principe peut être élargie à des monooxygénases FAD dépendante comme la styrène monooxygénase. Nous avons ainsi réalisé l'époxydation du styrène et de trois de ses dérivés. En validant l'approche [Cp*Ir(bpy-OMe)H]+/monooxygénase pour ces deux types de flavoprotéines, nous avons démontré l'applicabilité de notre méthode comme plateforme technologique pour toute (flavo)protéine impliquant le passage par une flavine hydroquinone.

Thesis resume

Two-component flavoprotein monooxygenases consist of a reductase and an oxygenase enzyme. The proof of functionality of the latter without its counterpart as well as the mechanism of flavin transfer remains unanswered beyond doubt. To tackle this question, we utilized a reductase-free reaction system applying purified 2,5-diketocamphane-monooxygenase I (2,5-DKCMO), an FMN-dependent type II Baeyer-Villiger monooxygenase, and synthetic nicotinamide analogues (NCBs) as dihydropyridine derivatives for FMN reduction. This system demonstrated the stand-alone quality of the oxygenase, as well as the mechanism of FMNH2 transport by free diffusion. The efficiency of this reductase-free system strongly relies on the balance of FMN reduction and enzymatic (re)oxidation, since reduced FMN in solution causes undesired side reactions, such as hydrogen peroxide formation. Design of experiments allowed us to i) investigate the effect of various reaction parameters, underlining the importance to balance the FMN/FMNH2 cycle, ii) optimize the reaction system for the enzymatic Baeyer-Villiger oxidation of rac-bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one, rac-camphor, and rac-norcamphor. Finally, this study not only demonstrates the reductase-independence of 2,5 DKCMO, but also revisits the terminology of two-component flavoprotein monooxygenases for this specific case. Temperature is a crucial parameter for biological and chemical processes. Its effect on enzymatically catalyzed reactions is known for decades, and the stereo- and enantiopreference are often temperature-dependent. Herein, and for the first time, we present the temperature effect on the Baeyer-Villiger oxidation of racemic bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one by a flavin hydroquinone-dependent monooxygenase. In the absence of a reductase and driven by the hydride-donation of a synthetic nicotinamide analogue the clear trend for a decreasing enatiopreference at higher temperatures (e.g. with e.e. of the substrate of 68.7% at 283 K to 37.8% at 303 K at 50% conversion) was observed. ‘Shape Language Modeling’ was used to design a description of the reaction in a shape prescriptive manner and for the uncertain reaction model, as ‘traditional approaches’ such as the E-value (Enantiomeric Ratio) appeared to be unsuitable due to the complexity of the system. One of the greatest challenges for two-component flavoproteins is an effective regeneration system for the flavin cofactor. Taking advantage of the capability of [Cp*Ir(bpy-OMe)H]+ to transfer hydrides to reduce flavins, we extended the scope of the pH- and oxygen-robust IridiumIII-complex to drive the enzymatic reaction of FMNH2- and FADH2-dependent monooxygenases. First, a Baeyer-Villiger oxidation catalyzed by the 2,5-diketocamphane-monooxygenase initiated by the organometal catalyst-mediated reduction of FMN was performed. The Ir-complex accelerated the nicotinamide-driven reaction by 90 times and enabled the use of formic acid as an inexpensive co-substrate. We demonstrate this proof-of-principle can be applied for another flavin-dependent monooxygenase for the enzymatic epoxidation of styrene and three styrene derivates by the styrene monooxygenase SfStyA. Validating the [Cp*Ir(bpy-OMe)H]+/monooxygenase-approach for both types of flavoproteins, we demonstrated the applicability of our method as a platform technology for any (flavo)protein applying flavin hydroquinone.